基于網絡藥理學、分子對接和實驗驗證探討肉蓯蓉治療肝纖維化的作用機制

張博銳，馬倩倩，王雯藝，張石蕾，劉 濤，趙 軍，馬 龍*

1新疆醫科大學公共衛生學院，烏魯木齊 830054；2新疆藥物研究所維吾爾藥重點實驗室，烏魯木齊 830004

肝臟作為人體重要的消化腺，一旦發生病變將影響人體正常的代謝功能[1]。研究顯示[2]，形成肝癌的重要途徑是肝纖維化(liver fibrosis)。肝臟受到刺激時，免疫細胞則分泌大量免疫調控因子，導致肝星狀細胞活化、增殖，合成大量膠原，在肝內沉積大量細胞外基質，造成纖維化形成[3]。因此，在肝臟病變過程的任何一個階段進行控制，都可能會減輕肝臟疾病的損傷，治療肝纖維化的研究顯得十分重要[4]。近些年來，有研究表明[5]，肉蓯蓉治療肝病具有明顯療效，在治療肝纖維化的方面表現出明顯優勢。

新疆道地藥材肉蓯蓉(Cistanches Herba)素有“沙漠人參”之稱，臨床應用已有數千年的歷史[6]。現代研究表明[7]，其具有抵抗衰老、保護肝臟、緩解疲勞、抗骨質疏松、潤腸通便等多種生物活性。You等[8]研究表明，肉蓯蓉苯乙醇苷能緩解肝臟纖維化程度。Zhang等[9]研究發現，肝臟星狀細胞的活化及肝纖維化能被肉蓯蓉苯乙醇苷脂質體抑制。然而目前對于肉蓯蓉治療肝纖維化的藥理作用及其機制尚不明確且有待闡明。

本研究應用網絡藥理學構建“成分-疾病-靶點-通路”網絡圖[10]，再進行蛋白質相互作用和靶點富集分析[11]，最終預測肉蓯蓉治療肝纖維化的相關靶點和通路，通過分子對接技術和動物實驗，為肉蓯蓉有效成分治療肝纖維化的藥理作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 篩選肉蓯蓉活性成分相關靶點

1.1.1 肉蓯蓉化學活性成分的篩選

以“肉蓯蓉”作為檢索詞，在中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)中篩選出口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18的成分作為活性成分[12]，再結合中醫藥百科全書數據庫(ETCM，http://www.tcmip.cn)、中醫藥研究綜合數據庫(TCMID，ttp://www.megabionet.org/tcmid/)、CNKI數據庫(https://www.cnki.net/)、PubMed數據庫(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)進行肉蓯蓉有關成分補充。

1.1.2 肉蓯蓉活性成分及肝纖維化疾病靶點

使用Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)，篩選肉蓯蓉活性成分對應的蛋白靶點[13]。再利用基因組注釋數據庫(GeneCards，https://www.Genecards.org/)和孟德爾遺傳數據庫(OMIM，https://omim.org/)數據庫，以“肝纖維化”作為關鍵詞檢索，在數據庫中獲得相關的蛋白靶點，最終獲得兩者共同的蛋白靶點[14]。

1.1.3 “肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-蛋白靶點”網絡的構建與分析

利用String數據庫(https://cn.string-db.org/)構建“肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-蛋白靶點”網絡，進行可視化處理[15]。其中每個節點代表基因、蛋白或活性成分，節點之間的連接代表活性成分與相關靶點之間的聯系，根據網絡中度值(degree)分析網絡中的核心基因，最終獲得蛋白互作網絡。

1.1.4 GO、KEGG富集分析

David數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)導入肉蓯蓉治療肝纖維化的靶點，進行GO、KEGG富集分析，根據Count數值進行篩選[16]。

1.1.5 分子對接

通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取肉蓯蓉主要活性成分的2D化學結構，在PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)中查找相關核心靶點蛋白3D結構，通過Autodock軟件進行分子對接，獲取結合能最高的位點，最后通過Pymol軟件進行可視化處理。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗動物

昆明種雄性小鼠60只，SPF級，體重18～22 g，購自新疆醫科大學實驗動物中心。生產許可證號為SCXK(新)2018-0002，使用許可證號為SYXK(新)2018-0003，倫理審批號：IACUC-20210326-10。

1.2.2 主要試劑

肉蓯蓉苯乙醇苷(CPhGs)(購于新疆和田帝辰醫藥生物有限公司，批號：20180502)；復方鱉甲軟肝片(蒙古福瑞科技股份有限公司產品)；小鼠層粘連蛋白(LN)、小鼠透明質酸(HA)、小鼠III型前膠原(PCIII)、小鼠IV型膠原(Col IV)酶聯免疫ELISA試劑盒(北京江萊試劑公司，批號：JL20286-96T、JL2406-96T、JL20169-96T、JL20128-96T)；Masson三色染色液(珠海貝索，批號：20210115)；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(索萊寶HE染色試劑盒G1120)；SuperReal熒光定量預混試劑彩色版(SYBR Green，天根FP205-02)；FastKing RT Kit(With gDNase，天根KR116-02)；Transzol up(全式金ET111-01)。

1.2.3 主要儀器

HZQ-C全濕恒溫培養搖床(上海一恒科學儀器有限公司)；DK-8D電熱恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)；HC-3018R高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；Varioskan Flash酶標儀、QuantStudio 6實時熒光PCR儀(美國賽默飛世爾科技公司)；Retsch萊馳高通量組織研磨儀MM400；ST5020多功能染色機(上海徠卡貿易有限公司)。

1.2.4 實驗方法

動物隨機分為正常對照組、模型組、陽性對照組(840 mg/kg)、CPhGs高劑量組(CPhGs-H，700 mg/kg)、中劑量組(CPhGs-M，350 mg/kg)、低劑量組(CPhGs-L，175 mg/kg)；陽性對照組給予復方鱉甲軟肝片，參照藥品說明書(一次4片，一天3次；每片0.5 g)和人民軍醫出版社出版的《機能實驗教程》，進行人和小鼠體重等效劑量換算；CPhGs高、中、低劑量組根據相關文獻[17]和預實驗結果，大鼠CPhGs高、中、低劑量組(500、250、125 mg/kg)，依據大鼠與小鼠用藥劑量換算比例1∶1.4，換算小鼠給藥劑量CPhGs高、中、低劑量組(700、350、175 mg/kg)，每組各10只；正常對照組注射等量生理鹽水，其余各組小鼠均經腹腔注射10%的CCl4橄欖油溶液(5 mL/kg)，1周注射2次，注射8周，建立肝纖維化小鼠模型；正常對照組、模型組灌胃給予蒸餾水，其余各組均按設定劑量灌胃給藥8周[18]。

1.2.5 生化指標檢測

ELISA法以酶標儀檢測肝組織勻漿中LN、HA、PCIII、Col IV的含量，嚴格遵守試劑盒的說明。

1.2.6 肝組織病理學觀察

肝組織經4%多聚甲醛溶液固定、乙醇脫水、石蠟包埋后切片，進行HE、Masson染色，觀察肝組織切片。

1.2.7 實時熒光定量PCR法檢測PI3K、AKT mRNA的轉錄情況

取出小鼠肝組織并加入Transzol up試劑提取小鼠肝臟組織總RNA，采用RT-PCR法測定小鼠肝臟PI3K、AKT的mRNA轉錄情況。相關基因序列見表1。

表1 引物序列

1.2.8 統計學方法

2 結果

2.1 篩選肉蓯蓉有效成分

篩選出肉蓯蓉已知成分75種，設定OB≥30%、DL≥0.18為篩選的閾值，得到8個符合條件的活性成分：β-谷甾醇(β-sitosterol)、花生四烯酸(arachidonate)、蘇齊內酯(suchilactone)、鵝掌楸樹脂酚B二甲醚(yangambin)、槲皮素(quercetin)、丁派卡因(marckine)、毛蕊花糖苷(acteoside)、松果菊苷(echinacoside)，通過Uniprot數據庫共得到157個靶點基因(見圖1)。

圖1 肉蓯蓉-有效成分-靶點圖

2.2 “肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-蛋白靶點”網絡構建與分析

檢索GeneCards和OMIM數據庫獲得肝纖維化相關靶點1 005個，將篩選出來的肉蓯蓉157個潛在蛋白靶點和疾病肝纖維化相關的1 005個蛋白靶點進行去重處理，繪制韋恩圖(見圖2)，將92個共同靶點，導入String數據庫，進行可視化處理構建“肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-蛋白靶點”網絡(見圖3)，其中核心靶點為：AKT、ICAM1、MMP9、BCL-2、ADRB2、CASP3、JUN、PON1、PIK3CG、RXRA、CASP8、PPARG、BAX、NOS3、PRKCA、TGFB1、CASP9等。degree>50作為閾值，根據degree和combine score值大小繪制蛋白互作網絡圖(見圖4)。

圖2 肉蓯蓉治療肝纖維化的藥物-疾病共同靶點韋恩圖

圖3 肉蓯蓉治療肝纖維化的“成分-共同靶點-疾病”網絡圖

圖4 PPI網絡圖

2.3 GO、KEGG富集分析

通過David數據庫，將肉蓯蓉治療肝纖維化的92個蛋白靶點導入數據庫進行富集分析(見圖5)。分別選取細胞組分、生物過程和分子功能Count值排名前十的條目。其中生物過程涉及DNA轉錄的正調控、負調控凋亡過程、衰老、炎癥反應、對細胞增殖的正調控、凋亡、信號傳導等；分子功能主要包括酶、蛋白、轉錄因子和相同蛋白的結合、DNA結合、鋅離子結合等；細胞組分主要包括細胞核、細胞質、細胞外環境、等離子體膜、細胞膜、線粒體等。通過David數據庫并根據Count值篩選出前20條通路，對肉蓯蓉治療肝纖維化的潛在作用靶點進行通路富集分析(見圖6)，得到的主要通路有：PI3K-AKT(見圖7)、TNF信號通路、HBV信號通路等。

圖5 肉蓯蓉治療肝纖維化的潛在作用靶點的GO分析

圖6 KEGG信號通路富集分析

圖7 肉蓯蓉治療肝纖維化作用的PI3K-AKT通路

2.4 構建肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-靶點-通路網絡

可視化處理構建“肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-靶點-通路”網絡(見圖8)。

圖8 肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-蛋白靶點-通路

2.5 肉蓯蓉治療肝纖維化的活性成分分子對接結果

通過Autodock軟件對肉蓯蓉最重要的2種活性成分毛蕊花糖苷、松果菊苷與關鍵白蛋靶點ICAM1、AKT1、MMP9進行分子對接，結合能見表2。將結果導入Pymol軟件進行可視化，分子對接結果顯示，毛蕊花糖苷與AKT在ASN-54、TYR-272、LYS-297位置處形成氫鍵；毛蕊花糖苷與ICAM1在GLN-168、LYS-8、ILE-10位置處形成氫鍵；毛蕊花糖苷與MMP9在LEU-188、ALA-189、GLU-227、HIS-230、HIS-236、HIS-226位置處形成氫鍵；松果菊苷與AKT在GLU-356、HIS-297、ASN-296、ALA-226、LYS-294、GLU-228位置處形成氫鍵；松果菊苷與ICAM1在DA-7、DT-8、DT-11、DT-12、DC-13位置處形成氫鍵；毛蕊花糖苷與MMP9在HIS-230、HIS-236、HIS-226、GLU-227、ALA-189、LEU-188、TYR-248位置處形成氫鍵(見圖9)。

表2 主要活性成分與關鍵蛋白靶點結合能

圖9 分子對接結果

2.6 各組小鼠LN、HA、PCIII、Col IV含量的差異

模型組與正常組相比LN、HA、PCIII、Col IV含量升高，且差異具有統計學意義(P<0.01)；CPhGs高、中、低劑量組與模型組相比明顯降低LN、HA、PCIII、Col IV含量(P<0.01)，結果說明CPhGs具有抗肝纖維化的作用(見表3)。

表3 各組小鼠LN、HA、PCIII、CoL IV含量的差異

2.7 肝組織病理學觀察

HE染色(見圖10)：正常組肝細胞形態正常，肝小葉結構完整，無變性壞死的肝細胞及炎細胞分布，匯管區清晰可見，中央靜脈周圍有放射整齊排列的肝細胞。模型組有明顯的肝細胞點狀壞死、增殖、水腫、炎細胞浸潤和大量嗜酸性顆粒。高、中、低劑量組和陽性對照組肝細胞壞死程度較輕，嗜酸性顆粒明顯減少。

圖10 CPhGs對CCl4致肝纖維化小鼠肝組織病理學改變的影響

Masson染色(見圖11)：正常組肝細胞形態結構完整，膠原染色后僅見血管壁有少量膠原纖維；模型組出現大量藍色纖維形成的假小葉包繞匯管區，可見大量空泡的形成。高、中、低劑量組和陽性對照組可顯著降低肝臟組織肝纖維化水平，匯管區周圍藍色纖維明顯減少。

圖11 CPhGs對CCl4致肝纖維化小鼠肝組織膠原纖維改變的影響

2.8 實時熒光定量PCR法檢測PI3K、AKT mRNA的表達

與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織中PI3K、AKT mRNA表達量顯著上調(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組及肉蓯蓉苯乙醇總苷高、中、低劑量組中PI3K、AKT mRNA表達量顯著減少(P<0.01)(見表4)。

表4 小鼠肝組織PI3K、AKT mRNA轉錄

3 討論與結論

肝纖維化的發展過程復雜，各細胞因子及各細胞通路之間相互“交流”、相互影響，形成了一個相互作用的復雜網絡。因此單靶點、單通路治療很難起效，中藥具有多成分、多作用靶點和作用途徑復雜等特點，從而系統地對人體進行調節。肉蓯蓉具有保護肝臟的作用，通過中藥數據庫TCMSP等數據庫得到肉蓯蓉有效成分：毛蕊花糖苷、松果菊苷、β-谷甾醇、花生四烯酸、蘇齊內酯、鵝掌楸樹脂酚B二甲醚、槲皮素、丁派卡因。有研究表明[19]，肉蓯蓉苯乙醇苷類是肉蓯蓉主要活性成分，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷被認為是肉蓯蓉發揮藥效的主要生物活性成分，通過網絡藥理學我們得到毛蕊花糖苷和松果菊苷作用與肝纖維化相關靶點，并通過分子對接進行驗證。

松果菊苷、毛蕊花糖苷作為肉蓯蓉中主要成分，通過調節肝星狀細胞凋亡發揮抗肝纖維化的作用[20]。ICAM1、AKT、MMP9可能是松果菊苷、毛蕊花糖苷治療肝纖維化的作用靶點，ICAM1作為一種細胞黏附因子，肝臟損傷的情況下會大量表達，可以通過抑制ICAM1過表達，抑制肝纖維化的發展[21]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)是PI3K下游的一個重要靶激酶，活化的AKT進一步激活，促進肝星狀細胞增殖，加速肝纖維化的進展，相反通過抑制AKT則會抑制肝纖維化的發生[22]；MMP-9可降解正常肝臟膠原基質，破壞肝細胞內環境，促進肝星狀細胞活化、分泌大量的膠原蛋白，促進肝纖維化的發展，相反通過抑制MMP-9則會抑制肝纖維化的發生[23]；本實驗使用CCl4建立肝纖維化小鼠模型是經典的造模方法之一，CCl4通過腹腔注射進入動物體內，相比較正常組，模型組小鼠LN、HA、PCIII、Col IV含量明顯升高；相對于模型組，CPhGs高、中、低劑量組明顯降低LN、HA、PCIII、Col IV含量；HE和Masson檢測結果表明：與模型組比較，CPhGs高、中、低劑量組肝細胞壞死程度較輕，嗜酸性顆粒明顯減少，匯管區周圍藍色纖維明顯減少。以上結果說明肉蓯蓉苯乙醇總苷抑制肝纖維化的進展可能與ICAM1、AKT、MMP9靶點有關，需要進一步對相關蛋白表達進行檢測。

肝纖維化的產生由多種因素引起，其中PI3K-AKT通路是由通路富集分析獲得排名靠前的通路，PI3K-AKT信號通路參與調控細胞增殖與凋亡、誘導人類腫瘤發生、乙肝病毒基因的轉錄、是治療肝纖維的重要通路之一[24]。PI3K-AKT通路能激活肝血管的形成，改善血供，重建細胞外基質，調節細胞自噬，抑制肝細胞的凋亡，促進肝細胞的增殖，從而導致肝纖維化發生[25]。松果菊苷、毛蕊花糖分別可以通過調節ICAM1、AKT、MMP9靶點抑制肝臟細胞的增殖和活化，肉蓯蓉苯乙醇總苷可能通過參與肝臟細胞的能量代謝、增殖、凋亡三個方面干預肝臟纖維化的進展，通過實時熒光定量PCR檢測表明：與正常組相比，模型組小鼠肝組織中PI3K、AKT mRNA表達量顯著上調；與模型組相比，肉蓯蓉苯乙醇總苷高、中、低劑量組中PI3K、AKT mRNA表達量顯著減少，其機制可能抑制PI3K-AKT通路的激活，延緩肝纖維化的進展。

綜上所述，肉蓯蓉苯乙醇總苷可以有效緩解CCl4誘導的小鼠肝纖維化，其機制可能與PI3K-AKT信號通路介導的肝星狀細胞的增殖活化有關，本研究結果為進一步深入探討肉蓯蓉的中藥藥理作用奠定基礎。