基于網絡藥理學、分子對接及實驗驗證研究知母-黃柏藥對抗炎的物質基礎

蘇 萌，譚福雄，呂 潔，雷莉妍*

1陜西中醫藥大學 陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心 秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室(培育)陜西省創新藥物研究中心，咸陽 712083；2西安中醫腦病醫院，西安 710000

炎癥是機體受到創傷后感染或自身免疫損傷時產生的一種可溶性因子與細胞之間復雜的相互作用[1]。炎癥的產生與多種因素有關，病毒、細菌和真菌等病原體入侵都會誘發機體炎癥[2]。炎癥一旦產生，可能誘發嚴重的醫學后果。研究顯示，慢性或頻繁的炎癥可以誘發癌癥及自身免疫性疾病[3]。

藥對是介于單味藥和復方之間的配伍單元，既具有復方靈活加減的特性，又具有單味中藥化學成分相對簡單的特點[4]。知母-黃柏藥對出自《蘭室秘藏》，具有滋陰清熱、瀉火解毒的功效，主治陰虛火旺等癥[5]。知母-黃柏藥對在臨床上為常見藥對，多個方劑及中成藥都包含該配伍，研究表明該藥對或包含該藥對的方劑有一定的抗炎作用。Mao等[6]研究發現知柏地黃丸可以調節炎性因子，促進炎性反應損傷的愈合。Zuo等[7]通過臨床研究發現，包含知母-黃柏的三花湯加減方治療慢性前列腺炎108例，有效率可達83.5%。并且有現代藥理研究顯示，知母-黃柏藥對對慢性前列腺炎也有顯著的治療作用[8]。本課題組前期研究顯示，知母-黃柏藥對水提液的30%乙醇洗脫部位在細胞水平有顯著的抗炎作用[9]。為了進一步探討知母-黃柏的抗炎機制，本研究擬先通過網絡藥理學及分子對接技術對知母-黃柏的抗炎機制進行預測，并通過細胞炎癥模型進行驗證。本研究將為知母-黃柏藥對的臨床應用及基礎研究提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

知母飲片(批號：20200301)、黃柏飲片(批號：20200301)購于陜西興盛德藥業有限責任公司，規格為1.0 kg；脫水淫羊藿素購于北京索萊寶公司(批號：412B022，純度98%)。

1.2 細胞

小鼠RAW 264.7細胞(編號：3131C0001000800 013)購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.3 試劑

RPMI 1640培養基(批號：2121143)購于美國Hyclone公司；胎牛血清(批號：1903320)購于以色列Biological Industries公司；青-鏈霉素(批號：0010419)購于以色列Biological Industries公司；IL-6、TNF-αELISA試劑盒(批號：M201210-004a，M201210-102a)購于深圳欣博盛生物科技有限公司；細胞級二甲基亞砜(批號：710N0310)購于北京索萊寶公司；無水乙醇(批號：20210508)購于天津市天力化學試劑有限公司。

1.4 儀器

311型細胞培養箱(美國Thermo公司)；Thermo Multi-skan GO多功能酶標儀(美國Thermo公司)；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；DSZ2000X型倒置顯微鏡(重慶澳浦光電技術有限公司)；Agilent 1290型高效液相色譜串聯AB SCIEX 4500 Qtrap三重四級桿線性離子阱質譜儀(美國Agilent公司，美國AB SCIEX公司)；KQ-300DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(Sartorius科學儀器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 知母-黃柏藥對網絡藥理學及分子對接分析

1.5.1.1 知母-黃柏活性成分及靶點收集篩選

在TCMSP數據庫(https://tcmspw.com/index.php)分別搜索知母、黃柏的化學成分，按照生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18的原則對各化合物進行篩選[10]。在TCMSP平臺篩選各活性成分的靶點。通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)將得到的活性成分靶點蛋白轉化為相應的基因簡稱。

1.5.1.2 炎癥靶點收集及篩選

在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)以“inflammation”為關鍵詞檢索，得到炎癥相關的靶基因，去重復值后以“相關性得分”≥10進行篩選。借助于jvenn在線工具(http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)繪制韋恩圖，將知母-黃柏的靶基因與炎癥靶基因相互映射，得到知母-黃柏干預炎癥的潛在靶基因。

1.5.1.3 構建藥物-炎癥-靶基因可視化網絡

將知母-黃柏干預炎癥的靶基因和炎癥相關的靶基因導入Perl語言中，得到網絡連線信息和節點類型等信息文件，將數據導入Cytoscape 3.7.2中構建藥物-炎癥-靶基因可視化網絡。利用Cytoscape 3.7.2軟件的插件cytohubba，分別根據degree值和最大集團中心度(maximal clique centrality，MCC)值篩選出前10個節點。

1.5.1.4 構建知母-黃柏干預炎癥的互作網絡

為了直觀地了解知母-黃柏干預炎癥的潛在靶蛋白之間的相互作用，使用STRING數據庫(https://string-db.org/)導入靶基因，選擇物種為人(homo sapiens)，得到知母-黃柏干預炎癥靶蛋白之間的相互作用網絡圖及對應信息，隱藏無關的靶蛋白。將得到的信息導入R語言中，利用腳本得到前10個出現次數最多的靶點柱狀圖。

1.5.1.5 知母-黃柏干預炎癥靶基因的功能和通路分析

為進一步探究知母-黃柏干預炎癥靶點的相關功能和涉及的通路，本研究使用R語言BiocManager包將靶基因名稱轉換為基因ID，在此基礎上，再使用R語言的bioconductor包、DOSE包等程序包，得到相應基因ID的功能和通路。

1.5.1.6 知母-黃柏活性成分與靶點分子對接驗證

利用“1.5.1.3”得到的3個化學成分和7個靶點，從PubChem數據庫中下載知母-黃柏3個核心化學成分的2D結構，并保存為*mol格式，利用PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)搜索7個“Homo Sapiens”的核心靶點蛋白的3D結構，下載其3D結構并保存為*sdf格式。借助分子對接軟件sybyl V2.1.1進行修復殘基、加氫、構建活性口袋、Surflex-Dock對接，導出*PDB格式。最后，通過pymol V2.4.0進行可視化處理。

1.5.2 知母-黃柏中脫水淫羊藿素含量測定

1.5.2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)，洗脫梯度：0～60 min，5%→99% B；65 min，99%→5% B；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量為5 μL。

1.5.2.2 質譜條件

采用ESI負離子模式進行掃描，檢測模式為多反應檢測(MRM)。離子化參數為離子噴霧電壓，負離子模式-4 500 V；霧化氣和輔助氣為氮氣；離子源溫度550 ℃，輔助氣GS1、GS2溫度為60 ℃，氣簾氣溫度35 ℃；離子掃描范圍：100～1 000 Da；掃描速率：200 Da/s；合物離子對，優化后的采集參數：去簇電壓(DP)為134.34 V、碎裂能量(CE)為-35.03 eV和碰撞池出口電壓(CXP)為-9.11 V。

1.5.2.3 供試品的制備

精密稱取知母、黃柏各30 g，加300 mL水，浸泡30 min，小火煮沸，并保持微沸煎煮1 h。倒出水煎液，加240 mL水，微沸煎煮1 h，合并兩次濾液并濃縮為浸膏，保存于-20 ℃冰箱，備用。精密稱取10 mg，加入1 mL甲醇，超聲20 min，混勻后靜置，取上清，過0.22 μm濾膜，濾液用甲醇稀釋100倍，進樣量為5 μL。

1.5.2.4 對照品的制備

精密稱取脫水淫羊藿素0.62 mg,加入1 mL甲醇，過0.22 μm濾膜，濾液用甲醇稀釋100倍，進樣量為5 μL。

1.5.3 知母-黃柏藥對抗炎活性檢測

1.5.3.1 RAW 264.7細胞培養

RAW 264.7細胞培養于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養液中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.5.3.2 藥物配制及實驗分組

稱取適量知母-黃柏藥對浸膏，用RPMI 1640基礎培養基配為2 mg/mL母液，用0.22 μm濾膜過濾除菌，置于4 ℃備用。

脫水淫羊藿素用細胞級二甲基亞砜(DMSO)配成10 mM儲液，經0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存備用。

根據網絡藥理學篩選結果對知母-黃柏及脫水淫羊藿素的抗炎活性進行驗證，每個藥物設置空白組、模型組(即1 μg/mL LPS)、藥物不同濃度處理組。知母-黃柏藥物低、中、高不同濃度為5、7.5、10 μg/mL，脫水淫羊藿給藥低、中、高不同濃度組為2.5、5、7.5 μmol/L。

1.5.3.3 細胞相對存活力檢測

取對數期細胞以1×105個/孔接種于96孔板，細胞貼壁后，用不同濃度藥物預處理細胞1 h，每孔加入終濃度為1 μg/mL LPS，空白組加入等量的基礎培養基。每組設3個復孔。培養結束后，每孔加入10 μL MTT試劑，繼續培養4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO孵育10 min，用酶標儀測定各孔450 nm處的吸光度值。

1.5.3.4 NO及炎癥細胞因子檢測

取對數期細胞以1×106個/孔接種于24孔板，細胞貼壁后，用不同濃度各藥物預處理細胞1 h，每孔加入終濃度為1 μg/mL LPS，空白組加入等量的基礎培養基。藥物處理20 h，收集各孔細胞上清，12 000 r/min離心15 min，取上清。采用Griess法測NO生成水平，ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6分泌水平。

1.5.4 統計學分析

2 結果與討論

2.1 網絡藥理學及分子對接結果

2.1.1 知母-黃柏藥對活性成分及靶點篩選結果

根據OB≥30%和DL≥0.18篩選后得到52個活性成分，其中知母15個，黃柏37個(見表1)。該52個活性成分在TCMSP中共檢索到619個靶點，經Uniprot數據庫查詢對應名稱并去重復可得102個相關靶點。

表1 知母-黃柏化學成分基本信息

2.1.2 炎癥的靶點篩選結果

通過GeneCard數據庫查找到有關炎癥的靶點共10 272個，通過去除重復值并以大于等于10分進行篩選，最終得到538個疾病靶基因。使用jevnn在線工具得到知母-黃柏干預炎癥的潛在靶基因22個(見圖1)。

圖1 知母-黃柏干預炎癥的靶基因

2.1.3 構建藥物-炎癥-靶基因可視化網絡

以篩選出核心化合物及核心靶點為基礎，得到藥物-化學成分-靶點可視化網絡圖，包含53個節點，106個邊(見圖2)。以degree與MCC同時滿足篩選出前10個活性較高的化學成分和靶點。結果顯示，degree、MCC結果相同(見圖3)，得到3個化學成分，分別為quercetin(槲皮素)、anhydroicaritin(脫水淫羊藿素)、β-sitosterd(β-谷甾醇)，7個靶點分別為VEGFA、RELA、PPARG、PRSS1、PTGS1、CASP3。

圖2 藥物-化學成分-靶點可視化網絡圖

圖3 重要活性成分-靶標圖

2.1.4 構建知母-黃柏干預炎癥的互作網絡

為進一步分析知母-黃柏抗炎的關鍵靶點信息，使用STRING數據庫檢索，并隱藏與其他蛋白無關的靶蛋白后，得到知母-黃柏干預炎癥的蛋白互作網絡圖(見圖4)。通過R語言處理得到前10個互作次數最多靶點柱狀圖(見圖5)。由圖可以看出，知母-黃柏干預炎癥的關鍵靶點與IL-6、VEGFA、CASP3、PPARG等密切相關。

圖4 知母-黃柏干預炎癥的蛋白互作網絡圖

圖5 互作次數多的靶點柱狀圖(前10個)

2.1.5 知母-黃柏干預炎癥靶基因GO及KEGG分析結果

用R語言腳本處理知母-黃柏干預炎癥的22個靶基因后得到63個GO富集相關的功能(見圖6)，83個KEGG富集的通路(見圖7)，根據P<0.01選擇發現GO為30個，KEGG為66個。篩選GO和KEGG各前20個進行條目分析。GO分析結果顯示，知母-黃柏治療炎癥靶點主要功能包括：激活轉錄因子結合、半胱氨酸型內肽酶活性參與細胞凋亡過程、轉錄因子活性等。通過KEGG富集分析后，發現知母-黃柏主要通過與TNF信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、剪應力與動脈粥樣硬化及卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等信號通路發揮作用。

圖6 知母-黃柏干預炎癥靶基因的GO功能富集分析

圖7 知母-黃柏干預炎癥靶基因的KEGG通路富集分析

2.1.6 成分-靶點分子對接結果

利用Degree及MCC結果得到3個活性較高的化學成分和7個主要靶點進行分子對接，其中RELA未找到對應唯一受體蛋白，故不納入。分子對接結果如表2顯示，脫水淫羊藿素與PPARG結合作用打分最高，β-谷甾醇、槲皮素均與靶點NR3C1結合作用最強。選取上述3個成分與其打分最高的蛋白分子對接結果進行可視化處理(見圖8)。

表2 分子對接結果

圖8 核心成分與靶點分子對接結果圖

2.2 知母-黃柏中脫水淫羊藿素含量測定結果

含量測定結果顯示，脫水淫羊藿素標準品的保留時間為48.91 min，知母-黃柏藥對中脫水淫羊藿素保留時間為49.25 min，經計算知母-黃柏藥對中脫水淫羊藿素含量為18.04%(見圖9)。

圖9 知母-黃柏中脫水淫羊藿含量測定

2.3 知母-黃柏藥對抗炎活性

2.3.1 知母-黃柏及脫水淫羊藿素對RAW 264.7細胞存活率的影響

模型組與空白組比較，模型組細胞存活率顯著降低；與模型組比較，各藥物均可不同程度的保護LPS誘導的細胞損傷，其中脫水淫羊藿素高劑量組與模型組比較具有統計學差異(見表3)。

表3 各組RAW 264.7細胞存活率比較

2.3.2 知母-黃柏及脫水淫羊藿素對RAW 264.7細胞NO、IL-6、TNF-α含量影響

與空白組比較，模型組NO、IL-6、TNF-α含量水平均顯著升高；與模型組比較，各藥物干預組不同程度降低NO、IL-6、TNF-α水平，且差異具有統計學意義。

表4 各組NO、TNF-α、IL-6含量水平比較

3 討論與結論

本課題組前期研究發現知母-黃柏有顯著的抗炎作用，為了探討其抗炎的物質基礎及可能的作用機制，本研究首先通過網絡藥理學篩選出知母-黃柏抗炎的核心化學成分槲皮素、β-谷甾醇和脫水淫羊藿素。有研究顯示，槲皮素可通過TLR4/NF-κB信號通路抑制小鼠RAW 264.7細胞炎癥，還可通過抑制NF-κB的表達有效地減輕人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞炎癥因子[10,11]。β-谷甾醇對啤酒中酵母誘導的大鼠發熱有良好的抗炎活性[12]。脫水淫羊藿素對酵母多糖誘導的小鼠腹膜炎具有顯著的保護作用，該作用可能與其抑制巨噬細胞鈣離子內流及iNOS表達有關[13]。分子對接結果顯示，脫水淫羊藿素與PPARG、β-谷甾醇和槲皮素均與NR3C1結合有較高的結合活性，其中脫水淫羊藿素與PPARG對接結果打分最高。這提示，脫水淫羊藿素可能是知母-黃柏抗炎的主要活性成分。

在網絡藥理學和分子對接的預測結果提示下，本研究檢測了知母-黃柏中脫水淫羊藿素的含量。結果顯示，脫水淫羊藿素在知母-黃柏中含量為18.04%。為進一步探究知母-黃柏及脫水淫羊藿素的抗炎活性及可能作用機制，我們在細胞水平研究了知母-黃柏及脫水淫羊藿素對相關炎癥因子生成的影響。結果表明，知母-黃柏及脫水淫羊藿素能顯著抑制LPS誘導的TNF-α、IL-6、NO生成。TNF信號通路是KEGG預測的知母-黃柏發揮抗炎作用最主要的通路。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)作為腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)之一，過氧化物酶體增殖物激活受體是核受體超家族的一個關鍵的轉錄調節因子。研究表明，TNF-α能抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARγ)活性，降低PPARγ的表達，并進一步以PPARγ依賴的方式活化NF-κB通路[14-16]，NF-κB會進一步促進下游炎癥相關基因如IL-6、iNOS等的表達[17,18]，而NO為iNOS催化產生[19]。因此，本研究推測知母-黃柏通過TNF通路抗炎是其重要機制之一。

本研究通過網絡藥理學篩選知母-黃柏抗炎的成分、靶點及信號通路，利用分子對接技術驗證脫水淫羊藿素與核心靶點結合能力，并通過含量測定驗證知母-黃柏中脫水淫羊藿素含量，細胞實驗驗證知母-黃柏及脫水淫羊藿素的抗炎作用，并對其抗炎的作用機制進行初步探討。本研究為藥物干預疾病的物質基礎及機制研究提供了可借鑒的方法，為臨床知母-黃柏用藥提供了研究基礎。