姜黃素超分子包合物改善乙醇誘導LO2肝細胞DNA損傷的作用機制

范土貴，曹笑皇，趙云濤，高加龍，劉穎，劉海，鐘賽意，秦小明，陳建平*

1(廣東海洋大學 食品科技學院， 廣東省水產品加工與安全重點實驗室, 廣東省海洋生物制品工程實驗室, 廣東省海洋食品工程 技術研究中心, 水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室, 廣東省亞熱帶果蔬加工科技創新中心，廣東 湛江，524088) 2(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心(大連工業大學)，遼寧 大連，116034)3(玉林師范學院 化學與 食品科學學院，廣西 玉林，537000)4(廣東海洋大學 濱海農業學院，廣東 湛江，524088)

長期及過量飲酒會引起人體肝臟的酒精性損傷，其最初表現為酒精性脂肪肝，嚴重情況下會發展成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化，最終引發肝癌[1]。目前全球約有5.3%的死亡與長期及過量飲酒有關，并且我國酒精性肝損傷的發病率呈逐年上升的趨勢，已嚴重威脅到人類的健康[2]。長期及過量飲酒會顯著降低線粒體中乙醛脫氫酶的活力，導致乙醇的代謝產物乙醛在肝臟中不斷地累積。乙醛在肝臟中堆積會對肝臟中的線粒體結構和微管系統進行破壞，抑制肝臟中微粒蛋白的分泌與合成，從而導致蛋白和脂質在肝臟中的累積[3]。乙醛還會顯著提高肝臟內活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平，ROS會破壞肝臟的氧化還原穩態，引起脂質過氧化，促進肝細胞凋亡，從而導致肝臟損傷[4]。因此，如何能夠有效地保護肝臟免受酒精性損傷已成為目前醫藥和食品領域研究的熱點。

姜黃素(curcumin，CUR)是一種從姜科姜黃屬植物根莖中提取得到的脂溶性多酚類物質，其分子式為C21H20O6[5]。目前，姜黃素在食品工業中常用于制備香料、色素和抗氧化劑等食品添加劑，廣泛應用于糕點、罐頭、飲料等食品中。相關研究表明，姜黃素能夠有效地調控細胞內的氧化應激反應，能提高細胞內相關抗氧化物質的表達量，能促進機體維持細胞內氧化還原穩態[6]。另外，姜黃素具有很好的護肝效應，可降低酒精、四氯化碳、硫代乙酰胺等各種化學藥物引起的肝損傷[7-8]。但是，姜黃素的水溶性及生物利用度極低，這極大地限制了其在酒精性肝損傷防治方面的應用。為此本課題組在前期研究中利用β-環糊精聚合物(β-cyclodextrin polymer, CDP)作為載體，通過超分子化學作用制備得到了水溶性和抗氧化活性良好的CUR/CDP，并發現CUR/CDP對乙醇誘導LO2肝細胞的損傷具有保護作用，能夠顯著提高乙醇損傷后LO2細胞內谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活力，并且顯著降低LO2細胞內MDA和ROS的含量[9-11]。然而，關于其具體的保護作用機制尚未明晰。故在前期研究的基礎上，本文通過流式細胞術、Western blot和ROS檢測試劑盒考察CUR/CDP改善乙醇誘導LO2肝細胞損傷的作用機制，為其在保護酒精性肝損傷中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素超分子包合物，實驗室自制；姜黃素標準品，美國Sigma公司；細胞裂解液RAPI、BCA蛋白測試盒和ROS檢測試劑盒、SDS-PAGE電泳液(Tris-Gly, Powder)、Western轉膜液、TBSTw (TBS with Tween-20)、Western封閉液、Western一抗稀釋液、Western二抗稀釋液、極超敏ECL化學發光試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗大鼠免疫球蛋白G(immunoglobulins G,IgG)(H+L)(HRP-labeled Goat Anti-Rat IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)和BeyoGelTMPlus PAGE預制膠(Tris-Gly, 8%, 10孔)，碧云天生物技術有限公司；β-Actin抗體(C4)、p-MDM2抗體(2G2)、cyclin B1抗體(GNS1)、p-ATM抗體(10H11.E12)、p53抗體(DO-1)、γ-H2AX抗體(Ser 139)和p-p38 MAPK抗體(D-8)，美國Santa Cruz Biotechnology公司；Phospho-p53 (Ser15)，美國Antibody Cell signaling technology公司；重組Anti-p21抗體[EPR362]，英國Abcam公司。胎牛血清、PBS、DMEM高糖培養基、0.25%胰蛋白酶溶液和雙抗溶液，美國Gibco公司；LO2 細胞，美國ATCC公司；分析純β-環糊精，山東新大精細化工有限公司；其他化學試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AUW120電子天平，日本島津公司；XRDKQ-500DB型數控超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；Varioskan Flash多功能酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；DZF-6050真空干燥箱，上海一恒科學有限公司；HL-6數顯恒溫水浴鍋，常州奧華儀器有限公司；Eppendorf 5810R冷凍離心機，德國Eppendorf公司；FD8508真空冷凍干燥機，韓國ilshin公司；FACS Aria流式細胞儀，美國Waters公司；Tanon 5200全自動化學發光圖像分析系統，廣州譽維生物科技儀器有限公司；EYELA旋轉蒸發儀，日本EYELA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CUR/CDP的制備

CUR/CDP的具體制備方法參考CHEN等[9]的方法進行。稱取15.76 g NaOH和20 g β-環糊精，加入32 mL H2O攪拌溶解，在30 ℃下緩慢加入環氧氯丙烷9.64 mL，攪拌24 h后，冷卻至室溫。經超聲功率為80 W超聲5 min后，將溶液倒入透析袋中透析至中性，抽濾去除不溶物，經0.45 μm纖維素膜過濾后旋蒸至黏稠狀，加入無水乙醇析出白色固體，經過濾、真空干燥即得β-環糊精聚合物。將姜黃素和β-環糊精聚合物按質量比1∶4 研磨混勻，加入50 mL蒸餾水，在120 W下超聲5 min后，經磁力攪拌2 d，將溶液抽濾、旋蒸和真空干燥，即得水溶性姜黃素超分子包合物。

1.3.2 細胞培養

LO2細胞經復蘇后轉移至DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清和1%雙抗溶液)中，并將細胞培養瓶置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，待細胞密度長至80%左右時進行傳代，取對數生長期的細胞用于后續的實驗。

1.3.3 CUR/CDP對乙醇誘導LO2細胞損傷后細胞周期的影響

將密度為2×105個細胞/mL的LO2細胞接種于6 cm培養皿中培養24 h，經10～80 μg/mL CUR/CDP處理細胞12 h后，去除培養基，加入5 mL 600 mmol/L乙醇培養細胞6 h。然后，細胞經胰酶消化后置于1 000 r/min下離心5 min，棄上清液，加入1 mL 70%冰乙醇，重懸細胞。將細胞懸液置于-20 ℃冰箱中過夜，次日，經1 000 r/min下離心5 min、棄上清液后，加入500 μL PI染料避光染色20 min后用流式細胞儀在激發波長為488 nm下進行檢測。

1.3.4 Western blot檢測蛋白表達情況

密度為2×105個細胞/mL的細胞經10～80 μg/mL CUR/CDP處理12 h和5 mL 600 mmol/L乙醇處理6 h后，棄培養基，加入RIPA裂解液冰上孵育 30 min，4 ℃，10 000 r/min 離心30 min，取上清液得到蛋白樣品，并用BCA試劑盒測其蛋白濃度。取25 μL 5×蛋白上樣緩沖液于100 mL樣品中，混勻后于95 ℃下加熱5 min。然后，將混合樣品經SDS-PAGE后，將其轉移至PVDF膜上。PVDF膜經Western封閉液封閉2 h后，用TBST洗膜3次，每次5 min。加入目標蛋白抗體，振蕩過夜。次日回收一抗，用TBST洗膜3次，每次5 min。再加入HRP標記的二抗孵育2 h，回收二抗，用TBST洗膜3次，每次 5 min。用ECL試劑盒進行化學發光，在Tanon 5200全自動化學發光儀上進行拍照，以β-actin作為內參。

1.3.5 CUR/CDP預處理對乙醇誘導ROS熒光強度變化的影響

將LO2細胞以10×104個細胞/mL的密度接種于24孔板中，每孔1 mL，培養24 h后，經10～80 μg/mL CUR/CDP培養12 h后用移液器去除培養液，加入1 mL 600 mmol/L乙醇培養6 h后，加入500 μL 濃度為10 μmol/L的DCFH-DA孵育30 min。用PBS洗滌3次，采用熒光倒置顯微鏡進行觀察及拍照。

1.3.6 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 CUR/CDP預處理對乙醇誘導細胞周期變化的影響

本課題組前期研究表明，CUR/CDP對乙醇誘導LO2肝細胞的損傷具有保護作用[10]。為了進一步闡明其相關的保護作用機制，本文采用流式細胞儀對細胞的細胞周期分布進行檢測。實驗結果如圖1、圖2所示。由圖1可知，空白對照組中細胞內G0/G1期、S期和G2/M期的細胞數目分別為(56.04±0.57)%、(35.13±0.46)%、(8.83±0.46)%。而乙醇處理組中細胞G0/G1期細胞數目從空白對照組的(56.04±0.57)%降低到(39.43±0.60)%，G2/M期的細胞數目從空白對照組的(8.83±0.46)%提高到(21.86±0.13)%。這表明細胞經乙醇處理后能顯著誘導細胞發生G2/M期細胞周期阻滯，使得G0/G1期細胞數目顯著減少。而經10～80 μg/mL CUR/CDP對細胞進行預處理后，能顯著降低乙醇誘導的G2/M阻滯，細胞數量分別從乙醇處理組的(21.86±0.13)%分別下降到(14.11±0.47)%、(11.75±0.32)%、(6.64±0.55)%和(4.76±0.36)%。上述結果表明，CUR/CDP能夠通過降低G2/M期細胞數量來改善乙醇誘導的LO2細胞損傷。

a-空白對照組；b-乙醇處理組；c-10 μg/mL CUR/CDP+乙醇組；d- 20 μg/mL CUR/CDP +乙醇組；e- 40 μg/mL CUR/CDP+乙醇組； f- 80 μg/mL CUR/CDP +乙醇組圖1 CUR/CDP預處理對乙醇誘導的細胞周期分布的影響Fig.1 Effects of CUR/CDP pretreatment on ethanol-induced cell cycle distribution

2.2 CUR/CDP預處理對乙醇誘導細胞周期蛋白cyclin B1及p21蛋白變化的影響

眾所周知，細胞周期是指細胞從上一次分裂完成開始到下一次分裂結束的全過程，是機體細胞正常生長中的基本過程，主要由DNA合成以及細胞分裂組成，其可分為G1期、S期、G2期和M期[13]。機體細胞的細胞周期進程會嚴格受到細胞周期蛋白(cyclin)與相應的細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)復合物的嚴格調控[14]。cyclin通過與相應的CDK結合形成cyclin-CDK復合物從而將CDK激活，進而推動細胞周期的進程。其中，細胞周期由G2期向M期的轉換進程是由cyclin B1-CDK1復合物嚴格調控的，而CDK1活性需要依賴cyclin B1含量的積累，即只有cyclin B1含量積累到一定程度時，與CDK1結合后激活CDK1，從而cyclin B1-CDK1復合物的活性才會被激活[15]。研究發現，cyclin-CDK復合物的活性會受到CDK抑制劑Cip/Kip家族蛋白如p21等的負向調節，Cip/Kip家族蛋白主要是通過抑制cyclin-CDK復合物的活性將細胞周期阻滯停留在某一時期[16]。p21是一種G2/M期周期蛋白依賴性激酶抑制因子，能夠抑制細胞周期蛋白依賴性激酶的活性，阻止其發揮作用，從而引起機體細胞發生G2/M期阻滯[17]。

為了進一步驗證流式細胞實驗的結果，本研究進一步采用Western blot技術檢測了與G2/M阻滯相關的p21和cyclin B1蛋白表達水平。實驗結果如圖3所示。由圖3可知，相比空白對照組，乙醇處理組中p21的蛋白表達量從空白對照組的(60.28±3.99)%升高至(100.00±1.50)%，而細胞周期蛋白cyclin B1的表達量從空白對照組的(100.00±1.50)%降低至(26.01±7.84)%。經不同濃度的CUR/CDP處理后，能夠顯著下調乙醇誘導的p21蛋白表達量的上升并上調乙醇誘導的細胞周期蛋白cyclin B1表達量的下降。上述結果表明，CUR/CDP能夠通過抑制p21蛋白的表達和促進cyclin B1的表達使得G2/M細胞數量減少從而改善乙醇誘導的G2/M細胞周期阻滯。

A-空白對照組；B-乙醇處理組；C-10 μg/mL CUR/CDP+乙醇組； D-20 μg/mL CUR/CDP+乙醇組；E-40 μg/mL CUR/CDP+乙醇組； F-80 μg/mL CUR/CDP+乙醇組(下同)圖2 CUR/CDP預處理對不同細胞周期中細胞含量的影響Fig.2 Effect of CUR/CDP pretreatment on cell content in different cell cycles 注：不同小寫字母間存在顯著差異(P<0.05)(下同)

a-不同處理組的cyclinB1和p21蛋白條帶;b-不同處理組的cyclin B1蛋白表達水平;c-不同處理組的p21蛋白表達水平圖3 CUR/CDP預處理對乙醇損傷LO2細胞的cyclin B1及p21蛋白表達水平的影響Fig.3 Effects of CUR/CDP pretreatment on the expression levels of cyclin B1 and p21 proteins in ethanol injured LO2 cells

2.3 CUR/CDP預處理對乙醇誘導DNA損傷及其調控蛋白表達水平的影響

研究發現，當細胞內DNA受到損傷無法及時修復DNA時，會引發細胞周期無法從一個階段向下一個階段轉變，從而引起細胞周期阻滯[18]。DNA受到損傷后，與DNA關聯密切的H2AX會在細胞內發生一系列應激反應，最終導致H2AX的磷酸化形成γ-H2AX。故γ-H2AX被認為是機體組織及細胞中DNA受到損傷的特定標志物之一[19]。此外，細胞內DNA的損傷會引起ATM蛋白磷酸化水平的升高從而誘導細胞發生凋亡或阻滯[20]。故本文運用Western blot進一步檢測與DNA損傷相關的γ-H2AX和p-ATM蛋白表達水平。實驗結果如圖4所示，相比空白對照組，乙醇處理后能顯著上調與DNA損傷有關的下游蛋白p-ATM和γ-H2AX的表達量，表明乙醇作用于LO2細胞后細胞內DNA受到損傷導致其下游蛋白表達量的升高。而經不同濃度的CUR/CDP處理后，p-ATM和γ-H2AX的蛋白表達量從乙醇處理組的(100.00±1.50)%和(100.00±1.50)%分別下降到(83.22±1.80)%、(63.47±4.80)%、(47.96±2.32)%、(37.11±2.09)%和(85.40±4.63)%、(73.82±5.44)%、(50.21±1.78)%和(41.90±4.15)%。上述結果表明，經CUR/CDP處理細胞后能減輕細胞內乙醇誘導的DNA損傷。

a-不同處理組的γ-H2AX和p-ATM蛋白條帶;b-不同處理組的γ-H2AX蛋白表達水平;c-不同處理組的p-ATM蛋白表達水平圖4 CUR/CDP預處理對乙醇誘導DNA損傷的相關調控蛋白表達水平的影響Fig.4 Effects of CUR/CDP pretreatment on expression levels of DNA damage-related regulation proteins induced by ethanol

2.4 CUR/CDP預處理對乙醇誘導p53及其上游蛋白表達水平的影響

研究發現，p53是一種腫瘤抑制因子，DNA損傷可以使p53發生磷酸化，磷酸化后的p53能夠通過激活p21蛋白抑制cyclin-CDK復合物的活性從而誘導細胞發生細胞周期阻滯[21]。同時，DNA損傷也能導致MDM2含量減少，后者能夠催化p53單泛素化和多泛素化導致p53降解，從而誘導p53失活[22]。此外，p53也受到上游蛋白p38MAPK的調控，后者參與了調控細胞周期及誘導細胞凋亡等生理過程，能夠誘導細胞發生G2/M細胞周期阻滯[23]。因此，為了進一步驗證上述實驗結果，本文采用Western blot技術對p53蛋白及其上游蛋白MDM2和p38MAPK的磷酸化水平進行了檢測。實驗結果如圖5所示。相比空白對照組，乙醇處理后能顯著上調p-p53和p-p38MAPK的蛋白表達量，同時顯著下調p-MDM2蛋白的表達量，表明乙醇作用于LO2細胞后啟動了p53信號通路及其上游的相關蛋白，繼而引發細胞發生G2/M阻滯。而經不同濃度的CUR/CDP處理后，能夠下調乙醇誘導細胞內的p-p53和p-p38MAPK蛋白表達量，分別從乙醇處理組的(100.00±1.50)%和(100.00±1.50)%下降到(92.56±4.37)%、(78.38±8.23)%、(63.07±5.73)%、(48.76±2.63)%和(89.67±3.06)%、(82.72±5.54)%、(69.26±4.71)%、(62.99±3.08)%，呈現出明顯地劑量效應。上述結果表明，CUR/CDP通過減輕DNA損傷導致其下游蛋白p-p53和p-p38MAPK的表達水平下調抑制乙醇誘導細胞發生的G2/M阻滯。

a-不同處理組的p-p38MAPK、p-MDM2、p53和p-p53蛋白條帶;b-不同處理組的p-p38MAPK蛋白表達水平; c-不同處理組的p-MDM2蛋白表達水平;d-不同處理組的p-53蛋白表達水平;e-不同處理組的p-p53蛋白表達水平圖5 CUR/CDP預處理對p53、p-p53、p-p38MAPK和p-MDM2蛋白表達水平的影響Fig.5 Effects of CUR/CDP pretreatment on the expression levels of p53, p-p53, p-p38MAPK and p-MDM2 proteins

2.5 CUR/CDP預處理對乙醇誘導ROS熒光強度變化的影響

研究表明，當肝臟受到過量乙醇刺激時，肝細胞內ROS含量會顯著增加，從而導致細胞內DNA發生損傷[24]。同時，ROS也能促進p38MAPK的活化從而誘導細胞發生G2/M期細胞周期阻滯[25]。為了驗證上述結論，本研究通過檢測DCFH-DA在細胞內的熒光強度來反映細胞內ROS的水平。當細胞內 ROS含量增多時，DCFH-DA的綠色熒光強度會增強，當LO2細胞內ROS含量減少時，DCFH-DA的綠色熒光強度會減弱。實驗結果如圖6所示，與空白對照組相比，乙醇處理組中細胞內DCFH-DA的綠色熒光強度較強，表明乙醇處理細胞后顯著提高了細胞內ROS的含量。經10～80 μg/mL CUR/CDP處理后，LO2細胞內DCFH-DA的綠色熒光強度逐漸減弱，這表明CUR/CDP能夠顯著降低乙醇誘導細胞內ROS的產生，并呈現出劑量效應。上述實驗結果表明，活性氧是乙醇誘導細胞發生G2/M阻滯的源頭，而姜黃素超分子包合物通過降低細胞內活性氧的含量來改善乙醇誘導的肝細胞損傷。

圖6 CUR/CDP預處理對乙醇誘導的ROS熒光強度的影響Fig.6 Effects of CUR/CDP pretreatment on ROS fluorescence intensity induced by ethanol

2.6 CUR/CDP預處理改善乙醇誘導肝損傷可能涉及的信號通路

基于上述研究結果，本文構建了CUR/CDP改善乙醇誘導LO2肝細胞損傷涉及的信號通路圖，如圖7所示，乙醇作用LO2肝細胞后，細胞內ROS含量急劇增加，導致細胞內DNA損傷從而引起γ-H2AX、p-ATM蛋白水平的上調和p-MDM2蛋白水平的下調。同時ROS含量的增加也上調了p-p38MAPK蛋白的表達水平。兩者的共同作用促進了下游蛋白p53的磷酸化，活化后的p53蛋白能夠上調p21蛋白的表達量。后者通過下調cyclin B1蛋白的表達從而抑制cyclin B1-CDK復合物的活性導致細胞發生G2/M細胞周期阻滯。而經CUR/CDP處理后，CUR/CDP從源頭上降低了細胞內ROS的含量，從而減弱了DNA的損傷，避免了DNA下游相關蛋白變化引發的G2/M期細胞阻滯，最終改善了乙醇誘導的肝細胞損傷。

圖7 CUR/CDP改善乙醇誘導LO2細胞損傷涉及的信號通路圖Fig.7 Signaling pathways involved in CUR/CDP improving injury of LO2 cells induced by ethanol

3 結論

本文通過流式細胞術、Western blot和檢測LO2肝細胞內ROS的熒光強度考察CUR/CDP改善乙醇誘導LO2肝細胞損傷的作用機制。實驗結果發現，CUR/CDP能夠通過降低細胞內G2/M期的細胞數量抑制乙醇誘導的G2/M期阻滯。進一步對其相關蛋白和細胞內ROS含量進行檢測發現，CUR/CDP通過降低細胞內ROS含量減輕DNA損傷引發其下游蛋白p-ATM、γ-H2AX、p-p53和p-p38MAPK表達水平的下調抑制乙醇誘導的G2/M期阻滯，最終避免細胞出現肝損傷。上述結果證實，CUR/CDP對乙醇誘導的肝細胞損傷具有保護作用，為其今后的臨床應用與開發提供了理論基礎和數據參考。