血漿神經酰胺與血管性事件相關性的meta分析

楊程緣，金奧銘，許杰，孟霞

心、腦血管疾病分別為全球致死病因的第1位和第2位[1]。合并高血壓、脂代謝紊亂、糖尿病、既往心腦血管疾病病史等危險因素可使血管性事件的風險進一步增高[2]。因此，探索針對性預測心、腦血管事件發生風險的新型生物標志物迫在眉睫。

神經酰胺（ceramide，Cer）作為鞘脂的中間代謝產物，可介導細胞凋亡[3]，有基礎研究表明，Cer可通過介導細胞凋亡參與心、腦血管疾病的病理生理過程[4]。目前已有臨床研究將以Cer為基礎建立的神經酰胺測試2（ceramide test 2，CERT2）評分應用于心血管性死亡的預測[5-6]。最新一項meta分析說明CERT2評分還可用于評估不良心血管事件的發生風險[7]。然而，CERT2評分內的特定Cer組分是否與不良心血管事件發生風險相關，CERT2評分是否也可有效預測單獨的心、腦血管事件，目前尚無明確結論。本研究旨在通過meta分析評估CERT2評分內的特定Cer組分與不良心血管事件發生風險之間的相關性，以及CERT2評分與心肌梗死、卒中發生風險之間的相關性。

1 對象與方法

1.1 文獻檢索 計算機系統性檢索PubMed、Embase、Library、Web of Science、中國知網、萬方和維普數據庫。檢索時限從建庫至2021年10月，收集涉及Cer與不良心血管事件、心肌梗死、卒中相關性的文獻。中文檢索策略：“神經酰胺”和（“心血管事件”或“心肌梗死”或“心梗”或“冠心病”或“腦梗死”或“缺血性腦卒中”或“腦血管閉塞”或“腦血栓”或“腦梗塞”或“缺血性中風”或“中風”或“缺血性腦血管病”或“腦栓塞”或“缺血性腦病”或“卒中”“缺血性卒中”）。英文檢索策略：（ceramides[Mesh] OR ceramides[allfields]）AND（cardiovascular disease[Mesh]OR cardiovascular disease[all fields]OR myocardial infarction[Mesh] OR myocardial infarction[all fields] OR stroke[Mesh] OR brain infarction[Mesh]OR stroke[all fields] OR cerebrovascular accident[all fields] OR infarct[all fields]OR infarction[all fields] OR brain infarct[all fields] OR brain infarction[all fields]）。根據系統分析和meta分析優先報告的條目（preferred reporting items for systematic review and meta-analysis，PRISMA）和流行病學觀察性研究的meta分析（meta-analysis of observational studies in epidemiology，MOOSE）報告規范，本研究執行meta分析和研究結果報告標準。

納入標準：①研究類型為觀察性研究；②針對存在心血管疾病風險因素患者，分析血漿Cer與不良心血管事件或心肌梗死或卒中發生風險的相關性的研究。排除標準：①摘要、病例報告、綜述、信件、社論、方案、動物或細胞研究、未發表的結果或信息以及隨機對照試驗；②不能直接或間接提供不同Cer組分，包括Cer（d18∶1/16∶0）、Cer（d18∶1/24∶0）和Cer（d18∶1/24∶1）或CERT2評分與不良心血管事件或心肌梗死或卒中發生風險RR或HR及其95%CI數據的研究；③重復發表的研究結果；④非隨機干預研究偏移風險評估工具（risk of bias in non-randomised studies of interventions，ROBINS-I）評估為中等偏倚風險等級以上的研究。

1.2 文獻篩選與方法學質量評價 根據入排標準，兩名研究人員獨立審查檢索所得的文獻標題和摘要，并獲取論文全文，進行文獻篩選。如意見不一致，則與第三方會商確定。對所有符合標準的研究，提取第一作者、發表年份、研究時間、研究類型、樣本量、研究人群特征、隨訪時長、研究終點和混雜因素等相關信息。

ROBINS-I是為非隨機干預性研究設計的偏倚風險評估工具，本研究利用ROBINS-I進行文獻質量評價[8]。該評價工具包括7個評價領域，分為干預前（混雜偏倚和研究對象選擇偏倚）、干預中（干預分類偏倚）和干預后（偏離既定干預偏倚、缺失數據偏倚、結局測量偏倚、結果選擇性報告偏倚）3個部分。評估者對相應領域的偏倚風險按照事先制定的標準給出“低、中、高、極高或不清楚”的風險評估。最終綜合單個領域的評估結果對研究的“整體偏倚”風險作出評價。

1.3 CERT評分和神經酰胺組分 CERT2評分由4種組分組成，包括3種不同的Cer組分、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）及其比值：Cer（d18∶1/24：1）/Cer（d18∶1/24∶0）、Cer（d18∶1/16∶0）/PC（16∶0/22∶5）、Cer（d18∶1/16∶0）/PC（14∶0/22∶6）、PC（16∶0/16∶0）?？偡指鶕鲜鼋M分的四分位數計算，范圍是0～12分。根據總分將個體分為4個風險等級：0～3分為低風險，4～6分為中風險，7～8分為高風險，9～12分為極高風險。

本研究分別對CERT2包含的3種特定Cer組分——Cer（d18∶1/16∶0）、Cer（d18∶1/24∶0）和Cer（d18∶1/24∶1）與不良心血管事件發生風險的相關性，以及CERT2評分與心肌梗死或卒中發生風險的相關性進行meta分析。

1.4 統計學方法 應用STATA 15.1軟件進行統計學分析。3種特定Cer組分和CERT2評分均為連續變量，研究報告其HR及95%CI。用Q檢驗和I2進行異質性檢驗并評估納入研究的異質性。當P＞0.1，I2＜50%，采用固定效應模型計算合并效應HR，反之采用隨機效應模型。meta分析時進行了多因素校正，校正變量包括臨床特征和實驗室指標。

2 結果

2.1 文獻檢索結果、研究一般特征及質量評價共檢索到5837篇相關文獻，剔除重復文獻2002篇和閱讀標題、摘要后發現的不符合入排標準的文獻3678篇。通過對剩余157篇文獻進行通讀全文，去除不合格文獻151篇，最終納入6篇文獻（7項研究），共覆蓋30 886例患者。所有納入研究的整體偏倚風險為“中風險”，即納入的觀察研究都被認為是非隨機研究的可靠證據，但與設計良好的隨機試驗不等同。文獻篩選流程和納入的研究基本特征分別見圖1和表1。

表1 納入研究基本特征

圖1 文獻篩選流程及結果

2.2 神經酰胺檢測方法 Carvalho等[9]的研究利用親水性相互作用LC（HILIC色譜柱）MS/MS定量檢測患者血漿Cer組分，使用Agilent 1260 LC系統和Agilent 6430三重四極質譜儀（Agilent科技公司，加利福尼亞州圣克拉拉）在HILIC色譜柱（馬薩諸塞州沃爾瑟姆賽默飛世爾科技公司）（100×2.1 mm；粒徑2.6 mm）上分離提取的脂質。Yin等[10]的研究

采用超高效液相色譜-使用配備ESI探針并與安捷倫1290 infinity LC系統（安捷倫，加利福尼亞州帕洛阿爾托）連接的AB Sciex四極質譜儀6500（馬薩諸塞州弗雷明翰市Sciex）對血漿Cer進行串聯質譜分析。Mundra等[11]的研究使用同樣的Cer檢測策略，使用安捷倫1290液相色譜系統和安捷倫6490三重四極質譜儀，通過液相色譜和電噴霧電離串聯質譜進行血漿Cer分析。Gence等[12]和Hilvo等[5，13]的研究收集患者血漿樣本后，代謝組學分析在配備超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UHPLC）（日本京都島津Nexera-X2）的混合三重四極桿/線性離子阱質譜儀（QTRAP 5500，AB Sciex，Concord，Canada）上進行。PC與Cer來自相同的紙質提取物并進行分析。

2.3 特定神經酰胺組分與不良心血管事件關系meta分析結果 特定Cer組分與不良心血管事件風險的關系：共納入4項研究（3篇文獻）[9-11]，包括11 004例患者，其中發生不良心血管事件的患者2154例。Mundra等[11]的文獻涉及2項研究。Cer（d18∶1/16∶0）的異質性檢驗顯示I2=87.0%，P＜0.001，采用隨機效應模型，結果顯示Cer（d18∶1/16∶0）為不良心血管事件的獨立危險因素（HR1.13，95%CI1.02～1.24，P=0.013）。Cer（d18∶1/24∶0）的異質性檢驗顯示I2=67.6%，P=0.026，采用隨機效應模型，結果顯示Cer（d18∶1/24∶0）不是不良心血管事件的獨立危險因素（HR0.97，95%CI0.90～1.03，P=0.295）。Cer（d18∶1/24∶1）的異質性檢驗顯示I2=55.5%，P=0.081，采用隨機效應模型，結果顯示Cer（d18∶1/24∶1）不是不良心血管事件的危險因素（HR1.05，95%CI0.99～1.10，P=0.081）（圖2）。

圖2 特定神經酰胺組分與不良心血管事件關系的meta分析

2.4 CERT2評分與單獨卒中或心肌梗死關系meta分析結果 CERT2評分與卒中或心肌梗死發生風險的關系分析共納入3項研究（3篇文獻）[5，12-13]，包括19 882例患者。CERT2評分與卒中關系研究的異質性檢驗顯示I2=64.1%，P=0.062，采用隨機效應模型，結果顯示CERT2評分不是卒中的獨立危險因素（HR1.19，95%CI0.98～1.43，P=0.075）；CERT2評分與心肌梗死關系研究的異質性檢驗顯示I2=85.3%，P=0.001，采用隨機效應模型，結果顯示CERT2評分不是心肌梗死的獨立危險因素（HR1.10，95%CI0.95～1.29，P=0.209）（圖3）。

圖3 CERT2評分與單獨卒中或心肌梗死關系meta分析

3 討論

本研究通過分析已發表的血漿Cer與不良心血管事件或心肌梗死或卒中關系的觀察性研究，對CERT2評分內的特定Cer組分是否均與不良心血管事件發生風險相關，CERT2評分是否能夠針對性預測心、腦血管事件的發生這兩個待解決問題進行了探索。研究結果提示CERT2評分內的Cer（d18∶1/16∶0）組分是不良心血管事件發生的危險因素，而Cer（d18∶1/24∶0）和Cer（d18∶1/24∶1）與不良心血管事件之間無顯著相關性，另外，CERT2評分本身與單獨卒中或心肌梗死風險也無顯著相關性。

Cer屬于鞘脂代謝中間產物的一種，是構成細胞膜、外泌體等質膜的重要成分，并作為第2信使參與炎癥和氧化應激反應。動物實驗提示，Cer可能參與了卒中的病理生理過程。Nakane等[14]觀察到沙土鼠的海馬在腦缺血再灌注5 min、30 min和24 h時Cer水平顯著升高，鞘磷脂水平顯著降低。大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）可導致大鼠大腦皮層Cer水平升高[15-16]。在自發性高血壓大鼠中，MCAO之前進行短暫缺血預處理可顯著降低缺血區及周圍區域的Cer水平[16]。在缺血性卒中的小鼠模型中，神經磷脂酶活性的減弱可顯著減少腦組織損傷[17]。在一項模擬缺血性心臟病的細胞實驗中，通過RNA轉染和單細胞測序技術，使用特定Cer酶阻滯劑和RNA轉染調控缺氧狀態下小鼠心肌細胞Cer酶表達水平，進而控制Cer水平。實驗綜合分析轉錄組學數據、Cer酶和Cer水平，得出上調Cer酶表達水平可通過水解抵消缺血性損傷后Cer異常增高帶來的負面影響，促進心肌細胞存活，從而起到心肌保護作用的結論[18]。除此之外，使用能夠降低Cer水平的藥物可以防止載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）基因敲除小鼠動脈粥樣硬化病變的形成[18]。

血漿Cer作為心、腦血管事件發生風險分層的生物標志物的潛力已經得到了越來越多的關注。既往研究關于含有C16∶0、C24∶0、C24∶1?；溨坏腃er組分和不良心、腦血管事件的相關性結果并不一致。一方面，綜合其他涉及Cer與不良心血管事件相關性但未納入本次分析的研究來看[19-21]，含有C16∶0或C24∶1?；湹腃er組分更傾向于是不良心血管事件的危險因素，而C24∶0與不良心血管事件發生無關或只有較弱相關性，這與我們的meta分析結果部分一致。另一方面，綜合腦血管病領域內有限的研究報道，C16∶0、C24∶0傾向于是卒中發生的危險因素[20-22]。部分研究提示C24∶1與卒中發生正相關。但最近發表的一項對比急性缺血性卒中和無腦血管病對照組的研究中，C24∶1是唯一在缺血性卒中急性期水平降低的Cer組分，并且隨著距離發病時間的增加其水平進一步降低，這與其他研究結果相反[23]。由此可見，C24∶0、C24∶1?；溑c心血管疾病的關系可能不同于其與腦血管疾病的關系。CERT2評分包含C16∶0、C24∶0、C24∶1?；湹奶囟–er組分，既往有研究顯示每標準差增量的CERT2評分對應患者發生不良心血管結局風險升高20%[7]，而本研究未見CERT2評分與卒中之間存在顯著相關性。盡管前期關于Cer與心、腦血管疾病的相關性研究數量有限，部分還受到小樣本量和橫斷面研究設計的限制，但C24∶0、C24∶1與心腦血管疾病的不同關系可能解釋CERT2可以作為預測心血管事件的指標，但不能有效預測卒中結局，也進一步說明Cer在心血管領域內的研究結果并不能完全外推至腦血管病領域。本研究結果還顯示CERT2與單獨心肌梗死事件并無顯著相關性，提示CERT2并不能特異性預測心肌梗死的風險。未來需要高質量的臨床研究進一步探索卒中、心肌梗死特異性Cer的預測模型。

目前將血漿Cer應用于卒中發生風險預測的臨床數據十分有限，并且很多受樣本量小和橫斷面研究設計的限制，本研究的優勢是采用ROBINS-I工具對非隨機干預性研究進行質量評價，在保證納入研究質量的前提下，綜合而成樣本量大、隨訪時間長、有足夠的統計學效應來定量分析特定血漿Cer組分水平、Cer評分與血管性事件發生風險之間相關性的數據。未來需要補充Cer針對性應用于卒中和缺血性心臟病的相關數據，可探索Cer與不同血管性疾病亞型之間的關系，并進一步明確在疾病發病機制中起主導作用的特定Cer組分種類及其內在的作用通路。

【點睛】本研究是首篇針對CERT2評分的Cer組分及評分本身與不良心腦血管事件相關性進行的meta分析，結果顯示，CERT2評分本身不能反映卒中或心肌梗死的風險，但部分Cer組分與不良心血管事件風險升高有關。