高、低相對分子質(zhì)量再生絲素蛋白改性絲素纖維人工血管材料的探究*

于成龍 秦金橋 關國平 Turng Lih-sheng 王 璐

1.東華大學紡織學院，上海 201620；2.東華大學紡織面料技術教育部重點實驗室，上海 201620；3.威斯康星大學麥迪遜分校威斯康星探索研究所，麥迪遜 53705,美國

蠶絲作為一種天然的蛋白質(zhì)材料，在服用領域應用已有幾千年的歷史。近年來，蠶絲由于優(yōu)異的生物力學性能和生物可降解性能，在生物醫(yī)用領域逐漸為人們所重視[1-4]。絲素蛋白是蠶絲的主要組成部分，其質(zhì)量約占蠶絲質(zhì)量的70%～80%；其生物相容性較好，可生物降解，且降解周期可控；其在生物醫(yī)用材料領域的應用形式多種多樣，如薄膜、水凝膠或靜電紡絲膜等[5-7]。此外，絲素蛋白可獨立作為一種生長因子用于改性材料，或與其他生長因子、細胞因子共價結(jié)合,用于改性生物材料，調(diào)控細胞行為[8-12]。不同的制備方式可獲得不同相對分子質(zhì)量的再生絲素蛋白。有研究表明，相對分子質(zhì)量會影響再生絲素蛋白的可降解性、可紡性、水溶性、力學性能和生物相容性等[13-16]。故再生絲素蛋白相對分子質(zhì)量的大小是影響其應用范圍和使用價值的重要因素。

當今社會，心血管疾病威脅著人類的生命和健康。人工血管的移植替換是治療心血管疾病的一種有效方式。有研究證實，真絲管狀機織物可作為一種小口徑人造血管材料用于血管的移植替換[17-18]。Enomoto等[19]研究表明，改性的絲素纖維人工血管材料在移植到小鼠腹主動脈一年后，其通暢率保持在85%，遠高于ePTFE人工血管；Ding等[20]利用蠶絲編織管，并結(jié)合硫化絲素蛋白工藝，制備出三層小口徑組織工程血管支架，并發(fā)現(xiàn)此支架的力學性能、血液相容性和細胞相容性均優(yōu)異。但也有研究表明，含絲膠的蠶絲纖維材料不利于內(nèi)皮細胞的黏附與生長[21]，同時其與血液直接接觸會刺激血小板的分化，造成凝血和血栓的形成[22-23]。因此，對絲素纖維材料進行改性處理，提高其生物相容性，具有非常重要的意義。

低溫等離子體處理是一種常用的材料改性方法，其利用高速運動的粒子轟擊材料表面，使材料表面分子發(fā)生電離或裂解，從而達到材料改性的目的[24]。低溫等離子體處理僅作用于材料表層，工藝簡單，且處理后無化學試劑殘留，適用于對生物醫(yī)用材料進行活化和改性處理，以改善材料的生物相容性、調(diào)控材料的親疏水性[25]。

本文先對真絲平紋織物脫膠后得到絲素纖維人工血管材料進行低溫等離子體處理，增加材料表面極性基團的數(shù)量，再通過化學偶聯(lián)劑1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基羰二亞胺(EDC·HCl)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，將采用尿素脫膠制備的高相對分子質(zhì)量再生絲素蛋白(HRSF)和采用質(zhì)量分數(shù)為0.5%的碳酸鈉溶液脫膠制備的低相對分子質(zhì)量再生絲素蛋白(LRSF)[26-28]分別接枝到低溫等離子體處理的絲素纖維人工血管材料表面，以期得到力學性能優(yōu)異、生物相容性良好的改性絲素纖維人工血管材料，以期為絲素纖維人工血管的開發(fā)與制備提供參考。

1 試驗部分

1.1 主要材料與儀器

真絲平紋織物，經(jīng)密為800根/(10 cm)，緯密為600根/(10 cm)，上海絲綢總公司；桑蠶蠶繭，上海絲綢總公司；無水碳酸鈉(Na2CO3)，分析純AR，上海凌峰化學試劑有限公司;尿素，分析純AR，國藥集團；溴化鋰(LiBr)，分析純AR，上海麥克林生化科技有限公司；氦氣(He)，分析純，上海浦江特種氣體有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，分析純AR，美國Thermo Fisher Scientific公司；PBS緩沖液，自制；抗凝兔血，內(nèi)含0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝劑，自取；胎牛血清(FBS)，美國Thermo Fisher Scientific公司；人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC),中國科學院細胞所；Cell Counting Kit-8 (CCK-8試劑盒)，上海翊圣生物科技有限公司。

HD-300低溫等離子體處理儀(常州中科常泰等離子體科技有限公司)；JAC-4020P超聲波清洗機(韓國KODO公司)；TM3000臺式掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；OCA15EC接觸角測量儀(德國Dataphysics公司)；HD-10厚度測量儀(滄州連峰試驗儀器廠)；Nicolet 6700傅里葉紅外拉曼光譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；YG(B)026 h-500醫(yī)用紡織品多功能強力儀(溫州市大榮紡織有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 真絲平紋織物的脫膠處理

考慮到脫膠處理對絲素纖維人工血管材料力學性能的影響，本文優(yōu)選采用文獻[28]中的脫膠方法，即先將真絲平紋織物裁剪成10 cm×10 cm的尺寸，按1∶100的浴比置于質(zhì)量分數(shù)為0.5%的Na2CO3溶液中煮沸處理30 min，之后取出織物，用去離子水沖洗，直至其表面無黏膩感。重復上述脫膠步驟3次，以提升真絲平紋織物的脫膠效率。隨后在60 ℃的烘箱中烘干織物，并放入恒溫恒濕室內(nèi)調(diào)濕備用。

真絲平紋織物脫膠后得到的絲素纖維人工血管材料命名為SFF。

1.2.2 低溫等離子體處理

本課題組前期的研究[29]表明：相同試驗條件下，He低溫等離子體處理對真絲織物的表觀形貌、結(jié)晶結(jié)構和力學性能等影響較小，同時還可以顯著提升織物表面的親水性；此外，He低溫等離子體處理可以提高絲素纖維人工血管材料表面極性基團的密度，為下一步接枝再生絲素蛋白提供更多的結(jié)合位點。因此，本試驗確定選用He為低溫等離子體處理氣體，同時根據(jù)前期的研究成果，確定最優(yōu)處理工藝為處理時間180 s、放電功率70 W、處理體系真空度50 Pa。

He低溫等離子體處理后的SFF命名為He-SFF。

1.2.3 高、低相對分子質(zhì)量再生絲素蛋白溶液的制備

高相對分子質(zhì)量再生絲素蛋白(HRSF)溶液的制備：將除去雜質(zhì)的蠶繭剪成小塊，按1∶30的浴比將其置于8.0 mol/L的尿素溶液中，100 ℃處理3 h，去離子水清洗干凈后得到無黏膩感的絲素纖維，再將絲素纖維置于60 ℃的烘箱中烘干，調(diào)濕備用；隨后，按1∶10的浴比將一定量的絲素纖維置于9.3 mol/L的LiBr溶液中，室溫(25 ℃)下攪拌至溶液中固體纖維完全溶解；將溶解纖維的溶液置于截留相對分子質(zhì)量在8 000～14 000的透析袋中，去離子水透析3 d，且每6 h更換去離子水一次，透析后即得到HRSF溶液，其質(zhì)量分數(shù)約為3.3%。利用質(zhì)量分數(shù)為30.0%的聚乙二醇(相對分子質(zhì)量為20 000)溶液可獲得相對高質(zhì)量分數(shù)的HRSF溶液，利用雙蒸水稀釋可獲得相對低質(zhì)量分數(shù)的HRSF溶液。

低相對分子質(zhì)量再生絲素蛋白(LRSF)溶液的制備：將除去雜質(zhì)的蠶繭剪成小塊，按1∶50的浴比將其置于質(zhì)量分數(shù)為0.5%的Na2CO3溶液中，100 ℃處理30 min，去離子水清洗干凈；重復該脫膠過程3次；將洗凈的無黏膩感的絲素纖維置于60 ℃的烘箱中烘干，調(diào)濕備用；隨后，按1∶10的浴比將一定量的絲素纖維置于9.3 mol/L的LiBr溶液中，90 ℃下攪拌至溶液中固體纖維完全溶解；后續(xù)透析及質(zhì)量分數(shù)調(diào)節(jié)步驟與HRSF溶液過程一致。

HRSF溶液和LRSF溶液制備完成后，利用SDS-PAGE凝膠電泳試驗測定兩者的相對分子質(zhì)量分布范圍。

1.2.4 高、低相對分子質(zhì)量再生絲素蛋白接枝改性處理

將1,6-己二胺溶于異丙醇中配制出濃度為20 g/L的溶液，再將He-SFF浸入配制的溶液中，37 ℃水浴反應1 h，使He-SFF表面氨基化，為下一步接枝再生絲素蛋白提供反應位點。按照m再生絲素蛋白溶液∶mEDC·HCl∶mNHS=1∶1∶2的要求，將EDC·HCl和NHS粉末溶于再生絲素蛋白溶液中，室溫下靜置反應15 min，得到活化的再生絲素蛋白溶液。隨后，將表面氨基化的He-SFF浸入活化的再生絲素蛋白溶液中，25 ℃條件下反應1 h，取出后用去離子水沖洗，晾干備用。

將接枝HRSF和LRSF的He-SFF分別命名為HRSF-SFF和LRSF-SFF。

2 性能測試與表征

2.1 再生絲素蛋白接枝改性效果表征

為分析再生絲素蛋白相對分子質(zhì)量和溶液質(zhì)量分數(shù)對接枝改性效果的影響，本文采用掃描電鏡法，利用TM3000臺式掃描電子顯微鏡對HRSF-SFF和LRSF-SFF的微觀形貌進行表征；采用稱取質(zhì)量的方法，對接枝前后絲素纖維人工血管材料的質(zhì)量增長率進行定量表征；利用厚度測量儀，對接枝前后絲素纖維人工血管材料表面的厚度進行測量，分析厚度的變化規(guī)律及厚度變化的離散程度，間接表征再生絲素蛋白在絲素纖維人工血管材料表面的接枝均勻性；利用超聲波對接枝后絲素纖維人工血管材料進行震蕩處理，測定并計算再生絲素蛋白的質(zhì)量損失率，以表征再生絲素蛋白在絲素纖維人工血管材料表面接枝的穩(wěn)定性。

2.2 接枝改性對絲素纖維人工血管材料性能的影響

2.2.1 基本性能表征

采用Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀對接枝前后絲素纖維人工血管材料的化學結(jié)構進行分析，掃描波長為500～4 000 cm-1；采用大榮026 G-500型織物強力儀，根據(jù)GB/T 528—1998，測試接枝前后絲素纖維人工血管材料的力學性能；采用OCA15EC型水接觸角儀，利用氣泡捕獲法測量接枝前后絲素纖維人工血管材料的水接觸角。

2.2.2 蛋白吸附試驗

前期研究將牛血清白蛋白(BSA)溶于PBS緩沖液中，配制成濃度為1.0～5.0 mg/L的BSA溶液；使用紫外分光光度計在278 nm波長下，測量不同濃度BSA溶液的吸光度值，并依據(jù)結(jié)果繪制BSA溶液濃度-吸光度值標準曲線，計算擬合曲線，得到回歸函數(shù)方程y=0.739 84x-0.046 16，其中R2=0.998 9。

將待測試樣裁剪成直徑為1.2 cm的圓片，滅菌后將其置于24孔板中，隨后加入1 mL濃度為2.5 mg/mL的BSA溶液，浸沒試樣；再將24孔板整體置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定蛋白吸附試驗后的BSA溶液在278 nm波長下的吸光度值，對照BSA溶液濃度-吸光度值標準曲線即可得到蛋白吸附試驗后BSA溶液的濃度；最后，根據(jù)被測試樣的質(zhì)量和試驗前后BSA溶液的濃度，計算出單位質(zhì)量試樣的BSA吸附量。

2.2.3 溶血性試驗

先取適量抗凝兔血，在5 000 r/min條件下離心5 min，獲取紅細胞；再取紅細胞1 mL，加入到34 mL的PBS溶液中，混勻后即得到紅細胞懸液。將1 mL紅細胞懸液加入4 mL雙蒸水中制得的混合液作為陽性對照組；將1 mL紅細胞懸液加入4 mL PBS溶液中制得的混合液作為陰性對照組。每種待測試樣裁剪成1 cm×1 cm尺寸，生理鹽水沖洗干凈后分別浸入1 mL紅細胞懸液和4 mL PBS溶液的混合液中，37 ℃培養(yǎng)箱中放置2 h，將所得的混合液作為試驗組。最后，陽性對照組、陰性對照組及試驗組均于5 000 r/min條件下離心3 min，取各自上清液，于540 nm波長下測出陽性對照組、陰性對照組及試驗組各自的吸光度(kOD陽性對照組、kOD陰性對照組及kOD試驗組)，并根據(jù)式(1)計算待測試樣的溶血率(kHR)[30]：

(1)

2.2.4 細胞毒性測試

依據(jù)標準ISO 10993-5:2009[31]，分別提取SFF、He-SFF、HRSF-SFF、LRSF-SFF 4種材料的浸提液，培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，隨后利用CCK-8測量細胞增殖率，評判材料的細胞毒性。

(2)

3 再生絲素蛋白相對分子質(zhì)量分析

所得HRSF和LRSF的SDS-PAGE圖譜如圖1所示，兩者的相對分子質(zhì)量均在一定范圍內(nèi)呈連續(xù)分布，其中HRSF相對分子質(zhì)量在117 000～460 000，LRSF相對分子質(zhì)量小于117 000。相對分子質(zhì)量的差異說明兩種制備方法對絲素蛋白的降解程度不同。隨著脫膠時間、脫膠溫度和脫膠堿液pH值的增大，絲素蛋白的降解程度隨之增大，再生絲素蛋白相對分子質(zhì)量有不同程度的下降[32-33]。本文中，質(zhì)量分數(shù)為0.5%的碳酸鈉溶液的堿性要高于8.0 mol/L的尿素溶液，同時前者對應的溶解溫度為90 ℃，高于后者對應的溶液溫度(室溫)。脫膠堿液pH值和溶解溫度的不同使得兩種脫膠方法對蛋白分子鏈的降解和破壞作用存在差異，故再生絲素蛋白的相對分子質(zhì)量存在明顯差異。

圖1 標記蛋白、HRSF和LRSF的SDS-PAGE圖像

4 結(jié)果與討論

所有測試數(shù)據(jù)均表述為“平均值±標準偏差”的形式，并采用單向方差分析(One-way analysis of variance)和LSD檢測的方法比較數(shù)據(jù)之間的顯著性差異。當p<0.05(*)時，兩組數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異。

4.1 再生絲素蛋白接枝改性效果

4.1.1 微觀形貌

所得HRSF-SFF和LRSF-SFF的SEM圖像如圖2所示，選用的再生絲素蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)分別為1%、3%、5%及7%，圖像放大倍數(shù)分別為200和1 000。

從圖2可以看出：

(1)HRSF會在絲素纖維人工血管材料表面聚集，形成一層蛋白膜，且高倍圖像顯示HRSF并未滲透到纖維之間。其中，當接枝的HRSF的質(zhì)量分數(shù)為1%時，材料表面蛋白膜覆蓋完整；隨著HRSF質(zhì)量分數(shù)的增加，材料表面的蛋白膜出現(xiàn)了破裂(破裂處見圖2中紅色圓圈處)，同時其在材料表面的分布量逐漸減小，并不再完整地覆蓋材料表面，原因可能與接枝高質(zhì)量分數(shù)的HRSF后，HRSF會在材料表面堆疊，清洗后有大量蛋白膜脫落有關。

圖2 不同質(zhì)量分數(shù)的再生絲素蛋白溶液制備的HRSF-SFF和LRSF-SFF的SEM圖像

(2)接枝LRSF后，材料表面都未見完整的蛋白膜，但紗線表面吸附了一層蛋白，且蛋白會滲透到紗線內(nèi)部。隨著LRSF質(zhì)量分數(shù)的提升，紗線及纖維的表面形貌都未見明顯變化。

研究表明，再生絲素蛋白的相對分子質(zhì)量越高，其分子構象越容易向穩(wěn)定的β-折疊結(jié)構轉(zhuǎn)變[34]。此外，本研究在活化HRSF和LRSF溶液的制備過程中，都加入了具有交聯(lián)作用的EDC·HCl和NHS，加速了再生絲素蛋白分子構象向β-折疊結(jié)構的轉(zhuǎn)變。因此推測，接枝HRSF時，EDC·HCl和NHS的存在使絲素蛋白分子間迅速發(fā)生交聯(lián)，并在絲素纖維人工血管材料表面形成了一層穩(wěn)定的β-折疊結(jié)構蛋白膜；而LRSF主要以相對分子質(zhì)量較小的短肽呈現(xiàn)，交聯(lián)速度較慢，這使得其需要足夠的時間與絲素纖維人工血管材料表面的氨基共價結(jié)合并吸附在紗線及纖維表面[35]。

4.1.2 質(zhì)量增長率

表1歸納了絲素纖維人工血管材料接枝改性后的質(zhì)量增長率。由表1可以看出：在再生絲素蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)相同時，接枝HRSF的質(zhì)量增長率明顯大于接枝LRSF的質(zhì)量增長率；隨著再生絲素蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)的增大，接枝HRSF的質(zhì)量增長率逐漸減小，接枝LRSF的質(zhì)量增長率逐漸增大，這與圖1的SEM圖像的結(jié)果基本吻合。

表1 接枝改性后絲素纖維人工血管材料質(zhì)量增長率 (%)

4.1.3 均勻性

測得SFF的平均厚度為(0.206±0.005)mm，不同再生絲素蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)制備的HRSF-SFF和LRSF-SFF的平均厚度及厚度的離散程度(即CV值)見表2。從表2可以看出：對于HRSF-SFF，其平均厚度隨著再生絲素蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)的增加并無顯著性變化(p>0.05)，但厚度CV值隨著再生絲素蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)的增加逐漸變大，說明接枝HRSF的均勻度隨再生絲素蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)的增加而降低；對于LRSF-SFF，其平均厚度隨著再生絲素蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)的增加呈顯著增大趨勢(p<0.05)，且厚度的離散程度較小，說明接枝LRSF較接枝HRSF更為均勻。這一現(xiàn)象也與接枝后絲素纖維人工血管材料表面的SEM圖像的結(jié)果基本吻合。

表2 HRSF-SFF和LRSF-SFF厚度測量結(jié)果

4.1.4 穩(wěn)定性分析

表3歸納了不同再生絲素蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)制備的HRSF-SFF和LRSF-SFF超聲震蕩后的質(zhì)量損失率。由表3可以得出：超聲震蕩后，HRSF-SFF的質(zhì)量損失率大于相同再生絲素蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)制備的LRSF-SFF，說明LRSF在絲素纖維人工材料表面的接枝穩(wěn)定性高于HRSF；同時，隨著再生絲素蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)的增加，兩種接枝改性絲素纖維人工血管材料表面的再生絲素蛋白的質(zhì)量損失率均逐漸增加。

表3 HRSF-SFF及LRSF-SFF超聲震蕩后的質(zhì)量損失率 (%)

4.2 接枝改性對絲素纖維人工血管材料性能的影響

4.2.1 紅外光譜

圖3所示為SFF、HRSF、LRSF、HRSF-SFF及LRSF-SFF的紅外光譜圖，可以看出所有試樣均具有相似的波峰結(jié)構。SFF中酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的吸收峰位置分別在1 628 cm-1和1 523 cm-1處；冷凍干燥后的HRSF和LRSF中酰胺Ⅰ的吸收峰位置分別在1 652 cm-1和1 645 cm-1處，酰胺Ⅱ的吸收峰位置分別在1 539 cm-1和1 537 cm-1處，分別對應α-螺旋和無規(guī)卷曲構象，這與Yin等[36]的研究結(jié)果相吻合；再生絲素蛋白接枝后，HRSF-SFF和LRSF-SFF中酰胺Ⅰ的吸收峰位置分別在1 622 cm-1和1 625 cm-1處，酰胺Ⅱ的吸收峰位置分別在1 514 cm-1和1 518 cm-1處，均轉(zhuǎn)變成了β-折疊構象[37]，這說明再生絲素蛋白在接枝過程中會發(fā)生結(jié)構重組，使無規(guī)卷曲構象轉(zhuǎn)變成更穩(wěn)定的β-折疊構象。只是β-折疊構象中存在大量的氫鍵和疏水性作用鍵，接枝后材料具有熱力學穩(wěn)定性，且不溶于水。此外，從圖3還可以看出，HRSF的β-折疊峰的位置偏移趨勢更加明顯，說明其結(jié)構更加穩(wěn)定。原因可能在于，絲素蛋白相對分子質(zhì)量偏小時，蛋白中的小分子肽鏈多，故分子構象轉(zhuǎn)變困難；絲素蛋白相對分子質(zhì)量偏大時，蛋白中的大分子肽鏈多，故分子構象轉(zhuǎn)變?nèi)菀住＿@與Zhong等[38]的研究結(jié)果相一致。

圖3 SFF、HRSF、LRSF、HRSF-SFF及LRSF-SFF的紅外光譜圖

4.2.2 力學性能

SFF的斷裂強度為(18.49±0.58)MPa、斷裂伸長率為(12.45±0.32)%、初始模量為(1.20±0.24)MPa。不同質(zhì)量分數(shù)再生絲素蛋白溶液接枝得到的HRSF-SFF及LRSF-SFF的力學性能測試結(jié)果見表4。由表4可以看出，接枝再生絲素蛋白后，材料的斷裂強度和初始模量較接枝前均有提高。這是因為再生絲素蛋白接枝后，HRSF-SFF紗線及纖維表面形成的蛋白膜填充了纖維間的空隙，這使得材料在受到拉力作用時纖維之間的滑移減小，同時蛋白膜也會貢獻一定的強力；對于LRSF-SFF，LRSF滲透到了紗線的內(nèi)部，使得纖維之間的抱合力增強(圖2)。另一方面，HRSF-SFF的斷裂伸長率較SFF有所提升，而LRSF-SFF的斷裂伸長率較SFF有所下降。造成此現(xiàn)象的原因是，蠶絲纖維的脫膠處理會造成絲素纖維力學性能的下降，接枝HRSF后形成的蛋白膜可以有效覆蓋并包裹受損的絲素纖維，使得HRSF-SFF的斷裂伸長率高于SFF；而LRSF接枝到絲素纖維的表面后，其對受損絲素纖維的力學性能無顯著提升作用，但是接枝后的水洗會對LRSF-SFF的斷裂伸長率產(chǎn)生負面作用。

表4 不同質(zhì)量分數(shù)再生絲素蛋白接枝得到的HRSF-SFF及LRSF-SFF的力學性能測試結(jié)果

值得注意的是，接枝再生絲素蛋白會使材料的剛度提升、彈性下降，所以接枝再生絲素蛋白的溶液質(zhì)量分數(shù)要適中。

4.2.3 親水性能

前期測試得到SFF的接觸角為(32.1°±0.6°)，He-SFF的接觸角為(22.4°±0.3°)。研究指出，材料接觸角的大小是材料表面的親疏水性和粗糙度共同作用的結(jié)果。疏水材料表面粗糙度增加，其接觸角值增大；親水材料表面粗糙度增加，其接觸角值減小[39]。絲素纖維本身是一種親水性材料，He低溫等離子體處理后其表面粗糙度增大，故He-SFF表面親水性增強。表5歸納了不同質(zhì)量分數(shù)再生絲素蛋白溶液接枝改性的絲素纖維人工血管材料的接觸角。由表5可以看出：接枝再生絲素蛋白后，絲素纖維人工血管材料的接觸角均有明顯提升，原因可能是接枝再生絲素蛋白后，絲素纖維人工血管材料原有的孔隙被填充，測定接觸角時，水滴無法有效地滲透致使接觸角增大；相較于LRSF-SFF,HRSF-SFF的表面親水性下降更為明顯，原因可能是接枝HRSF后，材料表面形成了結(jié)晶度更高的β-折疊結(jié)構的絲素蛋白膜，致使其親水性下降更加顯著。

表5 再生絲素蛋白接枝后絲素纖維人工血管材料接觸角測試結(jié)果

綜合考慮再生絲素蛋白的接枝效果，以及材料的微觀形貌、力學性能和親水性能，本文確定優(yōu)選質(zhì)量分數(shù)為1%的HRSF溶液和質(zhì)量分數(shù)為5%的LRSF溶液，用于后續(xù)的再生絲素蛋白接枝改性的研究。

4.2.4 蛋白吸附性能

圖4歸納了SFF、He-SFF、HRSF-SFF及LRSF-SFF對BSA的吸附性能。圖4中：SFF的BSA吸附量為15.76 mg/g；經(jīng)He低溫等離子體處理后，He-SFF的BSA吸附量減至12.36 mg/g；再生絲素蛋白溶液接枝后，改性絲素纖維人工血管材料的BSA吸附量均顯著提升，HRSF-SFF和LRSF-SFF的BSA吸附量分別達到了19.59 mg/g和18.84 mg/g。相關研究表明，BSA在血管植入材料表面的吸附可以有效提升材料的血液相容性[40]，而BSA的吸附效果又與材料表面的親疏水性有關，其傾向于吸附在親水性表面[41]。本文4.2.3節(jié)中，4種材料的親水性大小為HRSF-SFFLRSF-SFF>SFF>He-SFF，兩種試驗結(jié)果不一致。原因可能在于，本文中SFF和He-SFF的接觸角分別為(32.1°±0.6°)和(22.4°±0.3°)，都屬于高度親水；而蛋白質(zhì)分子在水溶液中采取的是疏水部分向內(nèi)、親水部分向外的天然構象，蛋白質(zhì)分子的周圍存在著較為致密的水化層。這些水化層與親水性表面間的排斥力不利于蛋白質(zhì)的吸附，故BSA在SFF和He-SFF上的吸附量要少于HRSF-SFF和LRSF-SFF，且BSA在SFF上的吸附量高于He-SFF。除親疏水性外，BSA的吸附還受材料表面化學成分、表面形貌、粗糙度和表面電荷等因素影響[42-43]。BSA的等電點為 4.7～4.9，在PBS溶液中，其帶負電荷。本文中，相比LRSF-SFF，HRSF-SFF引入了更多的再生絲素蛋白，其表面的正電荷量更高，所以HRSF-SFF的BSA吸附量更高，抗凝血性能更優(yōu)。

圖4 BSA吸附量測試結(jié)果

4.2.5 溶血率

依據(jù)ASTM F756-2017材料溶血特性的評定標準，當溶血率為0.0%～2.0%時評定生物材料不溶血，當溶血率為2.0%～5.0%時評定生物材料輕微溶血，當溶血率大于5.0%時評定生物材料溶血[44]。圖5為絲素纖維人工血管材料改性前后的溶血率測試結(jié)果，4種材料的溶血率均小于5.0%。其中：SFF和He-SFF的溶血率分別為2.8%和2.4%，屬于輕微溶血材料，原因與絲素纖維人工血管材料前期的脫膠處理沒有將容易引發(fā)溶血的絲膠和其他雜質(zhì)完全去除有關；HRSF-SFF和LRSF-SFF的溶血率分別為1.2%和1.6%，屬于不溶血材料，原因在于接枝再生絲素蛋白后，再生絲素蛋白會覆蓋甚至包裹材料表面的絲膠和雜質(zhì)，避免它們與血液的接觸。HRSF-SFF的溶血率更低，說明HRSF在材料表面形成的蛋白膜覆蓋并包裹絲膠和雜質(zhì)更有效，接枝HRSF可以更有效地降低材料溶血率，不溶血效果更顯著。

圖5 溶血率測試結(jié)果

4.2.6 細胞毒性

圖6反映了絲素纖維人工血管材料改性前后細胞毒性測試結(jié)果。由圖6可以看出，SFF和He-SFF兩者的細胞毒性無顯著性差異，原因可能與絲素纖維人工血管材料表面殘留的絲膠和雜質(zhì)產(chǎn)生了細胞毒性有關；接枝再生絲素蛋白后，材料的細胞增殖率顯著提升，表明細胞毒性下降，生物相容性好，這是由于接枝改性的絲素纖維人工血管材料表面可以提供更多的細胞結(jié)合位點，有利于細胞的黏附[45]。參照ISO 10993-5∶2009第5部分——材料的體外細胞毒性測試，當浸提液培養(yǎng)24 h后，若細胞增殖率>70.0%，則可判定該材料無細胞毒性[31]。測試發(fā)現(xiàn)：LRSF-SFF的細胞增殖率為67.7%，較未處理材料有明顯提升，但仍未達到無細胞毒性的標準；HRSF-SFF的細胞增殖率達到了72.3%，參照標準，其可判定為無細胞毒性，說明接枝HRSF后可以更為有效地覆蓋并包裹絲膠和雜質(zhì)，最大限度地減弱材料的細胞毒性。

圖6 細胞毒性測試結(jié)果

5 結(jié)論

利用HRSF和LRSF對He低溫等離子體處理后的絲素纖維人工血管材料進行接枝改性處理，并對接枝改性前后的材料進行一系列的性能表征，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量分數(shù)的HRSF和LRSF溶液的接枝改性效果存在差異，但都會在一定程度上提升材料的拉伸斷裂強度、初始模量和疏水性。綜合考慮接枝改性效果，確定優(yōu)選質(zhì)量分數(shù)為1%的HRSF溶液和質(zhì)量分數(shù)為5%的LRSF溶液分別對He-SFF接枝。生物學評價結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接枝HRSF可以實現(xiàn)更優(yōu)的抗凝血效果，顯著降低材料的血液相容性，減弱材料的細胞毒性，是一種實用且有效的改性方式，在絲素纖維人工血管材料的改性領域具有良好的應用前景。