基于響應面法的艾草總黃酮提取工藝優化

王麗煥，郭文娟，錢曉明

（1.天津工業大學紡織科學與工程學院，天津 300387；2.天津工業大學 化學工程與技術學院，天津 300387）

艾草（Artemisiaargyi），菊科蒿屬植物，分布于我國的東北、華北、華東、華南和西南等各省區，資源非常豐富，是一種廣泛應用的中藥材[1]。艾草，全草入藥，具有溫經、祛濕、散寒、止血、抑菌、抗蟲和抗氧化等功效，藥圣李時珍稱其為草醫，也有草中鉆石的稱號[2]。現代對艾草的藥理研究顯示，艾草具有抗菌、抑菌、抗病毒、抗氧化等藥理作用，因此，開發出了具有抑菌、增強免疫力等功效的產品，如艾灸條、艾葉貼等[3]?；诎莸幕钚猿煞趾退幚碜饔茫拱堇w維具有天然保健功能。

艾草改性竹黏纖維是將艾草提取液混入竹黏纖維紡絲液中，經紡絲及后處理得到的新型纖維，其中艾草提取液在纖維中的質量占比約為10%[4]。艾草改性竹黏纖維面料具有良好的吸濕排汗、清涼透氣和穿著舒適性，廣泛應用于兒童服裝、家紡、內衣、T恤衫、防護服飾等領域，具有廣闊的市場前景[5-7]。錢曉明教授等[8-9]利用艾草作為抗菌成分，制備抗菌纖維取得了良好效果。然而在艾草纖維的制備階段，添加艾草提取物時，因受到各種因素的限制，往往只是添加艾草水提取物，甚至是艾草藥材的細粉，嚴重影響了艾草抗菌效果的發揮。國內外學者對艾草的化學成分進行了較為廣泛的研究，發現艾草中化學成分主要為：揮發油類，如月桂烯[10]、水芹烯[11]、石竹烯氧化物[12]、桉油精、樟腦等[13]；黃酮類，如異澤蘭黃素、柚皮素[14]、高車前素[15]、洋芹素[16]等；以及多糖類、苯丙素類等。其中，黃酮類化合物在艾草中已發現有50余種，被認為是艾草抗菌的主要活性成分[17]。

本文應用超聲波輔助提取技術，采用單因素實驗與響應曲面分析法相結合，對艾草總黃酮的最佳提取工藝進行研究，以期得到抗菌性良好的艾草總黃酮提取物，為艾草提取物在紡織工業領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料與試劑：干燥艾草，采自湖北蘄春（2018年）；蘆丁對照品，上海源葉生物科技有限公司產品；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純，市售。

儀器：Q-250B3型高速多功能粉碎機，上海冰都電器有限公司產品；AR224CN型電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司產品；KQ-100B型超聲清洗機，昆山市超聲儀器有限公司產品；ZNCL-G型智能磁力攪拌器，鞏義市英峪高科儀器廠產品；UV2600型紫外-可見光分光光度計，日本島津公司產品。

1.2 艾草總黃酮的超聲提取方法

艾草粉碎后過篩，稱取2.000 g干粉，按一定料液比加入一定體積分數的乙醇水溶液，在一定溫度下浸泡5 min，在超聲波清洗機中提取一定時間，抽濾，棄去殘渣，合并濾液，取濾液作為供試品溶液。

1.3 紫外分光光度法測定總黃酮含量[18-19]

（1）首先，繪制蘆丁標準曲線。準確稱取蘆丁標準對照品5.0 mg放入錐形瓶，用體積分數50%的乙醇水溶液溶解，移入50 mL容量瓶定容至刻度線處，搖勻即可得到0.1 mg/mL的蘆丁標準液。然后分別準確量取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，定容，得到不同濃度的對照品溶液。各對照品溶液分別取2.0 mL至10 mL容量瓶中，分別加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，再加入4%氫氧化鈉4 mL，用60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻后靜置12 min，以試劑作空白參比液，采用紫外可見光分光光度計于507nm處測吸光度，以蘆丁濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。由蘆丁標準曲線可知，A=9.834 4C，R=0.999 9，表明線性關系良好。

（2）再測定總黃酮的含量。精密量取5.0 mL艾草濾液轉移到100 mL的容量瓶中，用體積分數60%的乙醇水溶液定容至刻度。再精密量取2.0 mL艾草/乙醇溶液，按照（1）中方法測定艾草總黃酮的吸光度，并計算艾草中總黃酮的提取率RT（mg/g）。

式中：A1為樣品溶液的吸光度；C0為標準樣品的濃度；M為稀釋倍數；V1為樣品溶液的體積；A0為標準樣品的吸光度。

1.4 單因素實驗

稱取2.000 g艾草，考察粉碎粒度、乙醇體積分數、超聲波提取時間、料液比、提取溫度、提取次數等對艾草中總黃酮提取率的影響，每組實驗進行3次，應用SPSS11.0統計軟件Duncan's multiple range test進行多組樣本間的差異顯著性分析。

1.5 響應面實驗

在單因素實驗結果的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合設計原理設計自變量，以艾草總黃酮提取率為響應值，通過響應曲面分析，對超聲波輔助提取艾草中總黃酮的工藝條件進行優化。利用響應面軟件分析進行實驗，分別測定總黃酮提取率，將實驗結果與實驗方案相比較，得到總黃酮實際平均提取率。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 艾草粉碎粒度對艾草總黃酮提取率的影響

取不同目數10、20、40、60、80、100目的艾草顆粒粉末，分別準確稱取2.000 g，按1∶20（g∶mL，下同）的料液比加入體積分數50%的乙醇溶液中，提取溫度為（20±5）℃，超聲提取20 min，結果如表1所示。

由表1可知，顆粒度為10～100目時，從艾草中提取的總黃酮量呈現先減后增的趨勢，100目時艾草中的總黃酮提取率達到最大值132.03 mg/g，且與其他粉碎度比較具有極顯著性差異。這是由于艾草的粉碎粒度越小，艾草總黃酮越易溶出，符合一般規律。

表1 粉碎粒度對艾草總黃酮提取率的影響Tab.1 Effects of crushing degrees on extraction rate of total flavonoids from Artemisia argyi

2.1.2 乙醇體積分數對艾草總黃酮提取率的影響

準確稱取100目艾草粉末2.000 g，料液比為1∶20，乙醇體積分數分別為0、10%、30%、50%、70%、90%，溫度為（20±5）℃，超聲提取20 min，結果如表2所示。

表2 乙醇體積分數對艾草總黃酮提取率的影響Tab.2 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total flavonoids from Artemisia argyi

由表2可知，隨著乙醇體積分數的增加，總黃酮的提取率呈現出先增加后降低的趨勢，當乙醇體積分數達到50%時艾草中總黃酮的提取率達到最高110.38 mg/g。艾草總黃酮為一類中等極性化合物，易溶于醇-水系統，極性過大或者過小都不適合總黃酮的提取。本實驗結果顯示，最適合的提取溶劑是體積分數為50%的乙醇水溶液。

2.1.3 超聲時間對艾草總黃酮提取率的影響

準確稱取100目艾草粉末2.000 g，料液比為1∶20，乙醇體積分數50%，提取溫度為（20±5）℃，超聲提取時間分別為20、40、60、80 min，實驗結果如表3所示。

由表3可知，超聲時間對總黃酮的提取量影響不顯著，超聲時間為40 min時總黃酮提取率達到最大值113.96 mg/g，但與20 min之間沒有顯著性差異。超聲時間80 min后，總黃酮的提取量有所下降，其原因可能為提取時間延長，某些成分被破壞所致。因此，選擇20 min為最佳超聲時間。

表3 提取時間對艾草總黃酮提取率的影響Tab.3 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from Artemisia argyi

2.1.4 料液比對艾草總黃酮提取率的影響

準確稱取100目艾草粉末2.000 g，乙醇體積分數50%，提取溫度為（20±5）℃，料液比（g/mL）分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶30，超聲提取20 min，結果如表4所示。

表4 不同料液比對艾草總黃酮提取率的影響Tab.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Artemisia argyi

由表4可知，料液比為1∶10～1∶30時，艾草中總黃酮的含量隨著料液比的增加而逐漸遞增，在1∶30時提取率達到116.47 mg/g，且與其他組別存在顯著性差異。料液比越大，使用的溶劑量越多，對艾草總黃酮的提取有益。

2.1.5 提取次數對艾草總黃酮提取率的影響

準確稱取100目艾草粉末2.000 g，料液比為1∶20，乙醇體積分數50%，提取溫度為（20±5）℃，超聲提取20 min，提取次數分別為1、2、3、4次，結果如表5所示。

表5 提取次數對艾草總黃酮提取率的影響Tab.5 Effect of extraction times on extraction rate of total flavonoids from Artemisia argyi

由表5可知，艾草中總黃酮的提取量隨著提取次數的增加而增大，提取4次時總黃酮提取率達到最大值142.63 mg/g，但提取4次和提取3次之間沒有顯著性差異。提取次數的增加會增加總黃酮的提取量，但提取次數過多會造成能源和溶劑的浪費。因此，本文選擇提取3次為最佳條件。

2.1.6 提取溫度對艾草總黃酮提取率的影響

準確稱取100目艾草粉末2.000 g，料液比為1∶20，乙醇體積分數50%，提取溫度分別為20、40、60、80℃，超聲提取20 min，結果如表6所示。

表6 提取溫度對艾草總黃酮提取率的影響Tab.6 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from Artemisia argyi

由表6可知，隨著提取溫度的升高，艾草中總黃酮的提取率逐漸增加，提取溫度為80℃時總黃酮的提取率達到最大值159.33 mg/g。當溫度升高時，分子擴散運動加快，有利于艾草總黃酮的溶出和提取。

2.2 響應面法優化艾草總黃酮的提取工藝

2.2.1 響應面實驗結果

根據單因素實驗結果，提取溫度、乙醇體積分數及料液比對艾草總黃酮的提取率影響較大。因此，本文選擇提取溫度（A）、乙醇體積分數（B）和料液比（C）作為自變量，以艾草總黃酮提取率（RT）為評價指標，根據Box-Behnken中心組合設計原理，通過Design-Expert 8.0 5b軟件設計三因素三水平實驗，因素水平表如表7所示，響應面實驗設計[20]及結果如表8所示。

2.2.2 回歸方程的建立及模型方差分析

使用Design-Expert 8.0 5b軟件對表8數據進行二次多元擬合處理，得到回歸方程：

表8 響應面實驗設計及其結果Tab.8 Design and results of response surface experiment

對該回歸模型進行方差分析，結果如表9所示。

表9 回歸模型方差分析Tab.9 Variance analysis of regression model

由表9可知，F=41.65，P<0.000 1，說明該模型的顯著性較高。失擬項P=0.004 8<0.01，表現為極顯著；校正確定系數R2=0.971 5，說明該模型能解釋97.15%的響應值變化，擬合程度良好，能夠較好地反應超聲提取溫度、料液比和提取溶劑（乙醇）與總黃酮提取率的關系；模型響應值的變異系數CV=3.13%，表明實驗操作重復性好（<10%）。由此說明，可以用該模型對總黃酮提取率進行分析和預測，各因素對總黃酮提取率的影響大小順序為料液比>乙醇體積分數>提取溫度。各因素對總黃酮提取率的交互影響不顯著。

2.2.3 響應曲面分析

以總黃酮提取率為響應值進行響應曲面分析，根據響應面軟件可以得到各因素對總黃酮提取率的交互影響3D響應面圖和等高線圖，如圖1—圖3所示。

圖1 提取溫度與乙醇體積分數交互作用對總黃酮提取率影響的3D響應面圖及等高線圖Fig.1 3D response surface and contour map of interaction between extraction temperature and ethanol volume fraction on extraction rate of total flavonoids

圖3 乙醇體積分數與料液比交互作用對總黃酮提取率影響的3D響應面圖及等高線圖Fig.3 3D response surface and contour map of interaction between ethanol volume fraction and solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids

響應面越陡峭的一方，其對提取的影響越大。由圖1可知，乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響大于提取溫度的影響；由圖2可知，料液比對總黃酮提取率的影響大于提取溫度的影響；由圖3可知，料液比對總黃酮提取率的影響大于乙醇體積分數的影響。由此可得，料液比對總黃酮提取率的影響最大，其次是乙醇體積分數，最后是提取溫度，與方差分析所得結論一致。

圖2 提取溫度與料液比交互作用對總黃酮提取率影響的3D響應面圖及等高線圖Fig.2 3D response surface and contour map of interaction between extraction temperature and solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids

2.2.4 最佳條件預測與驗證

通過Design Expert軟件進行數據擬合分析，得到最佳提取工藝為溫度80.15℃、料液比1∶40.16（g/mL）、乙醇體積分數47.59%，在此條件下總黃酮提取率為169.32 mg/g。為了便于操作，選取提取溫度為80℃，料液比為1∶40（g/mL），乙醇體積分數為50%，平行進行3組實驗，對最佳工藝進行驗證，結果表明總黃酮提取率為167.02 mg/g，與預測值基本吻合，說明預測模型可靠。

3 結論

采用超聲波輔助提取艾草總黃酮：

（1）單因素實驗結果表明，艾草粉碎粒度越大，提取效率越高；隨著乙醇體積分數的增加，總黃酮提取率先增加后降低；超聲時間對總黃酮提取率的影響不顯著；隨著料液比、提取次數和提取溫度的增大，艾草總黃酮的提取率逐漸增加。

（2）響應面實驗結果表明，對總黃酮提取率的影響大小順序為料液比>乙醇體積分數>提取溫度，各因素對總黃酮提取率的交互影響不顯著。本文所得預測模型可靠，可用該模型對總黃酮提取率進行分析和預測。

（3）結合單因素實驗及響應曲面法分析，得到超聲輔助提取艾草總黃酮的最佳工藝條件為艾草粉碎100目、乙醇體積分數50%、提取溫度80℃、超聲提取時間20 min、料液比1∶40（g/mL）、提取次數3次，在此條件下得到總黃酮提取率為167.02 mg/g。