甘蔗渣酶解制糖工藝的建立與優化

侯慶宇，楊前進，金瑞，張濛，田康明，王正祥*

1(天津科技大學 化工與材料學院，天津，300457)2(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)

甘蔗渣(sugarcane bagasse)是甘蔗制糖工業的主要固體副產物，聯合國糧農組織2019年統計數據顯示，全世界甘蔗渣產量達2.7億t，占甘蔗總產量的15%，我國甘蔗種植業每年約產生2 000萬t甘蔗渣[1-2]。以甘蔗渣為原料，開發生產動物飼料[3]、生物質板材[4]和綠色制漿造紙[5]等，已呈現廣闊應用前景。甘蔗渣燃燒發電后的甘蔗渣灰，可用作砂漿或混凝土添加劑，增加抗壓強度[6-7]。有研究表明，經化學修飾后的甘蔗渣對廢水中的金屬離子具有較好的吸附作用，有可能成為一類新型吸附劑[8]。但是，絕大部分的甘蔗渣仍被簡單焚燒或丟棄，不僅對環境造成污染，對資源也是極大的浪費。

與其他木質生物質相似，甘蔗渣的基礎組分為纖維素、半纖維素和木質素，經水解可生成可發酵糖，能作為發酵生產乙醇、乳酸等大宗產品的原料[9-10]。水解甘蔗渣為可發酵糖的常用方法包括化學法和酶解法。其中，化學法主要包括酸法、堿法和離子液體法等。硫酸由于價格低廉且水解效果好，常用于酸法水解，但是酸水解過程中生成的糠醛等物質會對后續發酵過程產生抑制作用[11]。堿法水解甘蔗渣可使甘蔗渣纖維內部發生膨脹、化學鍵斷裂、生成孔隙，有利于后續水解的進行[12]。但酸法和堿法直接制備可發酵糖存在諸多問題，如原料轉化率低、可發酵糖液需進一步純化精制等。離子液體雖然對纖維素具有良好的溶解性，但因其成本過高，不能廣泛應用于工業生產[13]。酶解法具有高效、專一、作用條件溫和等特點，被視為最有應用前景的生物質糖化方法并得到廣泛研究[14]。酶法水解甘蔗渣為可發酵糖理論上應配合使用纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶和蛋白酶等，具體需要就甘蔗渣酶解高效酶制劑篩選及其酶解工藝進行系統研究。同時，降低酶制劑使用成本，也是甘蔗渣作為工業原料應用于大規模工業化生產亟待解決的關鍵問題[15-16]。

我國已經能夠規模化生產生物質水解酶制劑，包括纖維素酶和木聚糖酶等。由于不同植物來源的生物質的組成差異明顯，甘蔗渣中纖維素和半纖維素的組成和結構存在一定特殊性，相關酶制劑的作用效果也存在一定差異性。為此，本文在分析現有商品酶制劑水解甘蔗渣效果的基礎上，進一步尋找新的生物質水解酶，通過實驗優化獲得酶的最優組合，最大程度的提高甘蔗渣的酶解效率并建立酶解工藝，進而通過發酵實驗檢驗所獲得的甘蔗渣水解糖直接用做工業發酵原料的可行性。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與菌種

甘蔗渣來自中國廣西某糖廠，由廣西科學院惠贈。商品纖維素酶(500 000 U/g)、木聚糖酶(290 000 U/g)，江蘇銳陽生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母膏，英國OXOID公司；其他試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

β-葡萄糖苷酶、外切葡聚糖酶和內切葡聚糖酶等生產菌株，為本實驗室前期構建并保藏，通過發酵法進行酶液制備[17]。發酵葡萄糖產乙醇生產菌種EscherichiacoliB0013-2012PA，為本實驗室前期構建并保藏[18]。

1.2 儀器與設備

5 L離位磁力攪拌發酵罐，上海保興公司；UV-1200紫外可見分光光度計，上海美譜達公司；SBA-40X生物傳感分析儀，濟南延和公司；1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.3 甘蔗渣的預處理

將甘蔗渣粉碎后過40目篩，與15 g/L的NaOH按照固液比1∶10(g∶mL)混合，在115 ℃下反應60 min，冷卻至室溫后用鹽酸調節pH至5.0左右。

1.4 酶解方法與酶制劑的篩選

取1 g甘蔗渣預處理后置于100 mL三角瓶，加酶混合后置于50 ℃水浴振蕩器，在120 r/min下進行酶解，定時取樣分析游離單糖的含量。

向甘蔗渣中加入50 U/g的商品纖維素酶和25 U/g 的商品木聚糖酶作為基礎和對照組，依次對β-葡萄糖苷酶、外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶進行篩選。利用纖維素酶間的協同作用，在外切葡聚糖酶和內切葡聚糖酶篩選時加入水解效果好的β-葡萄糖苷酶。酶解方法同上，定時取樣分析游離單糖的含量。

1.5 甘蔗渣水解液發酵乙醇

用氨水將甘蔗渣水解液pH調至7.0后加入5 L發酵罐中，接入10%種子液，控制總體積為2.5 L，在37 ℃ 下開始發酵。生長階段控制攪拌轉速為200～800 r/min、空氣流速為3～7 L/min，培養5 h后關閉通氣轉入厭氧發酵，控制攪拌轉速為200 r/min。定時取樣檢測葡萄糖、木糖和乙醇濃度，待葡萄糖消耗殆盡且乙醇不再增加時結束發酵。

1.6 分析方法

1.6.1 甘蔗渣組分分析

參考美國可再生能源實驗室(National Renewable Energy Laboratory，NREL)的方法[19]，對甘蔗渣的組成成分進行分析。

1.6.2 酶活力測定

內切葡聚糖酶的酶活力測定采用黏度法[20]，酶活力定義：在50 ℃和pH 6.0條件下，以CMC-Na為底物，1 min內降解1 mg CMC所需的酶量為1個酶活力單位(U)。外切葡聚糖酶的酶活力測定按照文獻[17]方法進行，酶活力定義：在50 ℃和pH 5.0條件下，1 min內水解CMC-Na產生1 μmol纖維二糖所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。β-葡萄糖苷酶的酶活力測定，以10 mmol/L的纖維二糖為底物，在50 ℃、pH 5.0下反應10 min，用生物傳感儀測定葡萄糖釋放量；酶活力定義：在50 ℃和pH 5.0條件下，1 min 內水解纖維二糖反應產生1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.6.3 發酵產物分析

發酵過程中定時取樣，生物傳感儀法檢測葡萄糖和乙醇含量，高效液相色譜法檢測木糖含量[21]。色譜柱選擇Prevail Carbohydrate ES 5u(250 mm×4.6 mm)，采用蒸發光檢測器，流動相為V(乙腈)∶V(水)=65∶35，流速為1 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量15 μL。

2 結果與分析

2.1 商品酶對甘蔗渣的水解作用

使用NREL推薦方法對甘蔗渣組分進行分析，本研究使用的甘蔗渣樣本含纖維素41.8%、半纖維素21.8%、木質素29.6%、灰分6.4%(質量分數)。

利用商品纖維素酶和商品木聚糖酶分別對甘蔗渣進行酶解，結果如圖1所示。隨著商品酶添加量的增加，甘蔗渣中纖維素和半纖維素的水解率也隨之上升。當纖維素酶的添加量達到30 000 U/g甘蔗渣時，纖維素和半纖維素的水解率分別可達到90.65%(以葡萄糖計)和97.89%(以木糖計)(圖1-a)；當木聚糖酶添加量為25 000 U/g甘蔗渣時，纖維素和半纖維素的水解率分別為92.84%(以葡萄糖計)和97.32%(以木糖計)，此時甘蔗渣中的纖維素和半纖維素幾乎被完全水解(圖1-b)。可見，在不考慮酶使用成本的前提下，現有商品纖維素酶和木聚糖酶皆可有效水解甘蔗渣；考慮使用成本，降低商品酶用量，則酶解效率和水解率大幅降低，其中纖維素的水解率降低尤為明顯，實現90%以上半纖維素、17%以上纖維素的水解需要20 000 U/g 的商品纖維素酶或1 000 U/g的商品木聚糖酶(圖1)。因同等活力的商品纖維素酶與商品木聚糖酶價格接近，故前者使用成本遠高于后者。可見，找尋新的特別是針對甘蔗渣中纖維素水解的酶制劑并與現有商品酶復合使用，有可能從根本上解決甘蔗渣酶制劑的專業性和水解效率不足的問題，而本研究使用的商品木聚糖酶相對商品纖維素酶具有成本優勢。

a-纖維素酶水解蔗渣；b-木聚糖酶水解蔗渣圖1 商品酶對甘蔗渣的水解作用Fig.1 Bagasse hydrolysis by commercial enzymes

2.2 甘蔗渣新酶的優選

β-葡萄糖苷酶的主要底物為纖維二糖及纖維寡糖，可消除纖維素酶水解產物對纖維素酶的抑制作用，在纖維素水解中發揮重要且特殊的作用[22]。為此，以50 U/g商品纖維素酶和25 U/g商品木聚糖酶為基礎和對照組，對多種β-葡萄糖苷酶的協同水解作用進行篩選，結果匯總于圖2。10種β-葡萄糖苷酶對商品酶水解纖維素皆有協同作用，以BgA的協同作用最好，葡萄糖釋放率較對照組提高了69.57%(2.34%/1.38%)。

圖2 β-葡萄糖苷酶的篩選Fig.2 Screening of β-glucosidases

外切葡聚糖酶從纖維素分子的末端水解釋放纖維二糖、葡萄糖和纖維寡糖，不同的外切葡聚糖酶的水解效率、底物結構和產物形成種類等皆不同[23]。通過篩選，獲得3種具有較好協同水解作用的外切葡聚糖酶，其中CbhC的水解效果最好，葡萄糖釋放率較只添加BgA時提高了38.24%(3.29%/2.38%)(圖3)。

圖3 外切葡聚糖酶的篩選Fig.3 Screening of exo-glucanases

同樣，通過篩選獲得了16種內切葡聚糖酶具有協同水解甘蔗渣纖維素的作用，其中EnglA、EglD和En3gA的作用最為明顯(圖4)。

圖4 內切葡聚糖酶的篩選Fig.4 Screening of endoglucanases

2.3 酶組合與優化

考慮用酶成本，以商品木聚糖酶(1 000 U/g)為基礎，進一步確認篩選得到的三類新酶與商品酶組合使用的協同效果，將BgA、CbhC、EnglA、En3gA和EglD 分別與商品酶復配，再進行甘蔗渣水解實驗，結果見表1。

表1 復合酶水解甘蔗渣結果Table 1 Bagasse hydrolysis by compound enzymes

可以看出，β-葡萄糖苷酶BgA與商品木聚糖酶復合水解時纖維素的水解率提高了16.52%，CbhC在與商品酶和BgA復合水解時纖維素的水解率較商品酶單獨作用時提高了22.68%，半纖維素水解率也分別提高了3.20%和4.43%。內切葡聚糖酶在初期篩選時有一定的水解效果，但是當商品酶的添加量增加后，重組內切葡聚糖酶與商品酶復配時，兩者間的協同作用不明顯，這可能是由于商品酶制劑中內切葡聚糖酶的占比多，當商品酶的添加量增大時，內切葡聚糖酶將纖維素長鏈水解為短鏈后，占比相對較少的外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶不足以將短鏈纖維素完全酶解成葡萄糖，此時反應體系內纖維二糖的積累會對酶解反應產生抑制作用，降低酶解效率[24]。可見，β-葡萄糖苷酶BgA和外切葡聚糖酶CbhC與本研究中使用的商品酶具有最優的協同作用，而內切葡聚糖酶的協同作用不顯著。

2.4 復合酶水解甘蔗渣工藝條件的優化

在50 ℃和pH 5.0的條件下，水解甘蔗渣24 h，以商品木聚糖酶(1 000 U/g)為基礎，改變BgA的添加量，測定甘蔗渣中纖維素的水解率，結果如圖5-a所示。隨著BgA添加量的增加，纖維素的水解率也隨之升高；當酶添加量為12 000 U/g時，纖維素水解率達到67.01%；繼續增加BgA添加量，水解率增幅減緩。以1 000 U/g商品酶和12 000 U/g BgA為基礎，改變CbhC的添加量，測定纖維素的水解率(圖5-b)。當CbhC添加量為0.175 U/g時纖維素的水解率為 76.44%，繼續增加用酶量，水解率沒有明顯提高。在此水解條件下，甘蔗渣中纖維素的水解率較只添加1 000 U/g商品酶時提高了59.42%。

a-BgA的添加量;b-CbhC的添加量圖5 酶添加量對纖維素水解率的影響Fig.5 Effect of enzyme doses on hydrolysis rate of cellulose

在上述最優酶添加量下，考察了不同酶解時間對酶解效率的影響，結果如圖6所示。當水解時間達到36 h后，半纖維素水解率可達到93.56%，此時纖維素的水解率為81.31%，這是由于半纖維素較纖維素更易溶于水或在水中發生溶脹，更易與酶發生水解反應。繼續延長酶解時間，半纖維素的水解率增幅明顯減緩，而纖維素在60 h時水解率達到90.16%，延長酶解時間后水解率增幅減慢，因此選擇60 h為最適酶解時間。

圖6 酶解時間對水解率的影響Fig.6 Effect of time on hydrolysis rate in enzymatic hydrolysis

至此，本研究獲得了可以與現有商品酶復合作用以提高甘蔗渣酶解效率的新酶分子及其最優酶組合并對酶解工藝進行了優化。優化的甘蔗渣酶解工藝：商品酶1 000 U/g、BgA 12 000 U/g和CbhC 0.175 U/g，在50 ℃、pH 5.0和120 r/min條件下水解60 h。此時甘蔗渣中纖維素的水解率為90.16%(以葡萄糖計)，半纖維素的水解率為95.65%(以木糖計)。在此復合酶的作用下，甘蔗渣中的纖維素和半纖維素均接近完全水解。

2.5 甘蔗渣水解液發酵生產乙醇

為檢驗優化酶解工藝制得的甘蔗渣水解液不經純化精制直接應用于發酵的可行性，以其為碳源，在5 L發酵罐中進行乙醇發酵實驗，結果如圖7所示。厭氧發酵階段消耗葡萄糖71.26 g/L，乙醇總產量為30.30 g/L，轉化率為42.52%，達到理論轉化率的82.92%；底物總轉化率為12.63 g/100g甘蔗渣。

本研究中采用的發酵菌種為木糖不代謝型[18]，菌種代謝葡萄糖為菌體和乙醇后，木糖幾乎全部保留在發酵液中，木糖回收率為99.52%。可在將葡萄糖轉化為乙醇的同時，從甘蔗渣酶解液中高效回收木糖，用于后續木糖的同步生產及木糖醇的制備[18]。

圖7 蔗渣水解液作為碳源發酵產乙醇Fig.7 Ethanol fermentation using bagasse hydrolysate as carbon source

3 結論

本研究揭示，β-葡萄糖苷酶BgA和外切葡聚糖酶CbhC對現有商品酶水解甘蔗渣具有最優的協同作用效果，可大幅降低商品酶的添加量并顯著提高甘蔗渣的水解效率。使用本研究獲得的酶制劑及其酶解條件，所制得的甘蔗渣水解液可以直接作為發酵碳源，應用于乙醇發酵和木糖同步回收。

4 致謝

廣西科學院為本研究提供了寶貴原材料和實驗方法；俄羅斯科學院聯邦研究中心(Federal Research Centre of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia)的Pavel Volkov博士在本研究過程中給予了寶貴幫助，在此一并致以衷心的感謝。