基于磁性納米探針的漁用麻醉劑三卡因的快速檢測方法

戴曉娜，陸亦寬，蔡楊楊，孫虹，盧瑛*，謝晶

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306) 3(農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海，201306)

水產品因富含蛋白質、不飽和脂肪酸和維生素，營養價值高，味道鮮美等特點深受消費者喜愛。近年我國水產品需求量持續上升，根據《2020中國漁業統計年鑒》統計顯示，2019年我國水產養殖總量達到6 480.36萬t[1]。但與此同時，水產品質量安全問題逐漸成為民眾關注的敏感話題[2]。水產品安全問題主要集中于運輸環節，為減少水產品在運輸過程中鮮活度的損失，主要采用漁用麻醉劑對其進行保活。常見的漁用麻醉劑有10余種，其中三卡因是美國藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)唯一批準可用于水產品的麻醉劑，因其在魚體中代謝快，對魚保活率高等優勢已被廣泛應用于活魚的長途運輸[3]。但是，水產品中殘留的三卡因長期被人體攝入后，會對人體造成過敏、造血紊亂甚至致癌等危害[4]。如湯保貴等[5]研究報道三卡因具有Ⅲ級毒性；劉偉等[6]研究報道了三卡因質量濃度大于60 mg/L時，會導致魚體處于亞健康狀態。因此，為保證水產品的食用安全性，部分國家對三卡因有嚴格的限制標準，美國要求采用三卡因麻醉的水產品需經21 d休藥期才能出售，允許最大殘留限量為1 μg/mL；加拿大要求其休藥期為5 d[7]。

三卡因的使用方法中，主要采用藥液浸泡對長途運輸中的魚類進行麻醉保活。部分研究學者就三卡因對不同水產品麻醉效果進行了研究。如李寧等[8]研究了不同質量濃度三卡因對大口黑鱸魚的麻醉效果，發現模擬運輸中三卡因的最適濃度為50～60 mg/L；采用55 mg/L的三卡因藥浴麻醉8 h，其殘留量達到36.24 mg/kg，復蘇3 d其殘留量為1.12 mg/kg。郝長杰等[9]研究了三卡因對暗紋東方鲀幼魚的麻醉效果，發現隨著三卡因質量濃度的升高，幼魚的麻醉時間逐漸縮短，復蘇時間延長，三卡因對暗紋東方鲀的有效麻醉質量濃度為120～140 mg/L。由此可見，無論是水產品運輸的水體，還是復蘇后的魚肉基質均有高濃度的三卡因。我國對三卡因在水產品中的使用沒有明確的規定，尚無相應的檢測標準，當前漁用麻醉劑濫用現象比較多。在經濟利益的驅使下，有商家未經休藥期就將水產品進行出售。試紙法主要用于目標物的快速篩查和初步分析，三卡因快速檢測試劑盒能夠讓相關部門快速了解污染情況。但國內市場目前沒有三卡因快檢試劑盒，現有的三卡因檢測方法主要是儀器分析方法，包括高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[10]、液相色譜串聯質譜法(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)[11]以及氣相色譜串聯質譜(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS/MS)[12-13]。而這些儀器分析法的樣本前處理復雜、耗時長，且對操作人員的技術要求高，難以滿足現場大批量快速篩查和檢測要求。由此可見，我國水產品中麻醉劑三卡因殘留檢測研究較少，尤其在漁用麻醉劑的快速檢測技術方面急需加強。

本研究構建的試紙條可用于水體以及魚肉基質中三卡因快速檢測。其中，磁性微球由超順磁性納米材料和高分子材料構成，其表面修飾有羧基，能夠與蛋白形成牢固的共價結合，不受外界溫度、濕度影響；由于具有超順磁性，在磁場作用下，標記操作簡單。此外，磁場具有穿透性強、背景干擾低的特點，以超順磁性納米材料標記的試紙條，可以通過磁信號分析儀捕捉硝酸纖維素膜(introcellulose，NC膜)從表面到底部的近90%信號，從而在實現復雜的反應體系中也能夠進行高靈敏度的定量檢測[14]。本研究以合成的3-氨基苯甲酸(半抗原)-BSA偶聯復合物作為抗原包被到試紙條的檢測線上，以磁性納米探針作為檢測標記物，在自主優化設計基礎上開發了基于磁性納米探針的三卡因快速檢測試紙條，并和經典的HPLC法進行對比，對試紙條的檢測性能進行了評價，旨在解決我國缺乏三卡因快速檢測方法問題，為今后政府部門對漁用麻醉劑的實時監管提供參考，為開發三卡因快檢試劑盒提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙泊酚、N，N-二甲基苯胺、布比卡因、苯佐卡因，上海源葉生物科技有限公司；利多卡因，上海國藥集團化學試劑有限公司；丁香酚，德國CNW公司；苯氧乙醇，BePure標準品有限公司；三乙胺、氯甲酸異丁酯、乙腈，上海麥克林生物科技有限公司；吐溫-20、牛血清蛋白(bovine albumin，BSA)、2-嗎啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid，MES)，上海生工生物工程技術服務有限公司；三卡因標準品，德國LGC公司；三卡因抗體，無錫迪騰敏生物科技有限公司；3-氨基苯甲酸、1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亞胺鹽酸鹽[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxy succinimide，NHS)，美國Sigma公司；羊抗鼠IgG、吸水墊、硝酸纖維素膜(CN140)、結合墊、樣本墊、覆膜、底板，上海捷寧生物科技有限公司；超順磁性納米材料 (PM3-020，180 nm，棕褐色)，上海奧潤微納新材料科技有限公司；均質子、QuEChERS 凈化管，逗點生物有限公司；TMB顯色液，上海泛柯實業有限公司；羊抗鼠IgG-HRP，上海威奧生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Bio-Tek酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；切條機，上海捷寧生物科技有限公司；HS-3垂直混合器，寧波新芝生物科技股份有限公司；KQ400-KDE超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；磁性分析儀MICAD-F1，自研；磁力架，上海奧潤微納新材料科技有限公司；QL-901 漩渦振蕩器，海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 3-氨基苯甲酸-BSA抗原的制備與表征

將6 mg 3-氨基苯甲酸溶于500 μLN，N-二甲基苯胺，以體積比100∶1加入三乙胺，垂直混合(4 ℃，15 min)，加入3 μL氯甲酸異丁酯，垂直混合(4 ℃，1 h)，再加1.4 mL BSA(2.5 mg/mL)，垂直混合(4 ℃，過夜)，用10 mmol/L PBS(pH 7.2)透析72 h后于-20 ℃保存備用。分別對2 mg/mL BSA、3-氨基苯甲酸和 3-氨基苯甲酸-BSA抗原進行紫外光譜掃描，觀察吸收峰位置。

1.3.2 間接競爭酶聯免疫吸附試驗

參考胥傳來等[15]方法，以碳酸鹽[CBS(Na2CO3和NaHCO3)，50 mmol/L，pH 9.6]為包被緩沖液，10 μg/mL 3-氨基苯甲酸-BSA抗原作為包被抗原4 ℃過夜反應。以50 g/L脫脂奶粉(200 μL/孔)作為封閉溶液，37 ℃反應2 h。0.5～2 700 ng/mL三卡因標準溶液先與三卡因單抗(1∶25 000,體積比)混合均勻(37 ℃預孵育1 h)后于加入酶標孔中37 ℃孵育1 h。充分洗滌后加入羊抗鼠IgG-HRP(用PBS以體積比1∶2 500稀釋)37 ℃孵育1 h，最后加入TMB顯色液25 ℃顯色15 min，加入2 mol/L硫酸終止反應，用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

1.3.3 磁性納米探針的制備

參考LIU等[16]方法，將500 g/L EDC和250 g/L NHS以體積比1∶2加入含有1 mg 磁性納米材料的MEST緩沖液[含有0.05%(體積分數)吐溫-20的MES緩沖液，10 mmol/L，pH=5.0]，垂直混合(25 ℃，30 min)，加入20 μg 三卡因單抗，垂直混合(25 ℃，3 h)，隨后加入0.5 mL 10 g/L BSA，垂直混合(25 ℃，30 min)，最后將探針置于1 g/L BSA、0.1g/L NaN3的BST[含0.05%吐溫(體積分數)-20的硼酸鹽緩沖液，5 mmol/L，pH 9.0]溶液中保存備用。

1.3.4 三卡因試紙條的構建

首先將0.5 mg/mL的3-氨基苯甲酸-BSA抗原、0.5 mg/mL羊抗鼠IgG以1 μL/cm的速度分別噴涂在NC膜的檢測線(T線)和質控線(C線)上，37 ℃下干燥2 h；然后把NC膜、樣品墊、結合墊、吸水墊及聚氯乙烯底板依次組裝，裁切成5 mm寬的試紙條密封干燥保存。

1.3.5 三卡因試紙條的樣品檢測和結果判定

將待測樣品、磁性納米探針和層析液[含有5%(體積分數)吐溫-20、200 g/L BSA的PBS緩沖液]以體積比100∶4∶15混合均勻后滴加于樣品墊上，靜置(傾斜10度)5～10 min后肉眼觀察T線和C線顯色情況，以PBS緩沖液代替樣品的混合溶液作為陰性對照。檢測結束后，C線顏色明顯，樣品的T線顏色明顯淺于陰性對照甚至完全消失的為陽性結果，而樣品的T線顏色與陰性對照接近或更深的則為陰性；如果檢測時C線未顯色表示該試紙條無效。反應20 min后采用磁性分析儀檢測試紙條T、C線上的磁信號值，繪制三卡因的定量標準曲線。采用公式(1)判定檢測結果。

(1)

式中：S，儀器檢測到的磁信號值；B，檢測樣本的T/C線的磁信號比值；B0，陰性對照的T線和C線的磁信號比值。當B/B0≥0.8時為陰性，0.3≤B/B0<0.8為弱陽性，B/B0<0.3為強陽性結果。

1.3.6 檢測性能評價

特異性：以10 μg/mL的三卡因、布比卡因、苯佐卡因、利多卡因、丁香酚、苯氧乙醇、丙泊酚7種常見漁用麻醉劑為樣品進行試紙條檢測，以PBS緩沖液代替樣品的混合溶液作為陰性對照。

靈敏度：采用0～500 μg/mL系列質量濃度三卡因溶液進行試紙條檢測，以肉眼觀察到T線消失時的三卡因濃度作為試紙條定性檢出限，每個濃度設置3個平行，以陰性樣本B/B0值的平均值減去三倍標準差對應的濃度作為檢出限。

重現性和穩定性：分別采用同一批次和不同批次的試紙條檢測0.5、1.0、5.0 μg/mL三卡因，根據檢測結果評價試紙條的重現性。利用高溫加速試驗原理[17]，將試紙條存放于60 ℃烘箱，每隔1 d檢測1次0.5、1.0、5.0 μg/mL三卡因樣品，持續5 d，根據檢測結果判斷試紙條的穩定性。

1.3.7 人工污染樣品檢測和方法學驗證

采集校園內不同的魚塘水作為稀釋溶液，分別制備0.5、1.0、5.0 μg/mL三卡因人工污染水體。此外，將草魚洗凈，取部分魚肉樣品于組織勻漿機攪碎混勻，放置-20 ℃冰箱保存備用。取5 g勻漿后的魚肉于50 mL離心管，加入三卡因標準品進行混合，加入500 μL 去離子水和一粒均質子渦旋振蕩5 min，渦旋混勻后加入1 mL乙腈振蕩提取(25 ℃，10 min)，隨后加入1 g MgSO4渦旋振蕩30 s，離心收集上清(4 ℃，4 000 r/min，5 min)，過凈化管小柱凈化，收集流出液，60 ℃氮吹至近干，加入PBS定容至2.5 mL，制備0.5、1.0、5.0 μg/mL三卡因人工污染魚肉提取液。過0.22 μm膜，收集濾液作為樣品，分別用HPLC和試紙條進行檢測，依據定量結果計算回收率。

2 結果與分析

2.1 3-氨基苯甲酸-BSA抗原的鑒定

3-氨基苯甲酸-BSA分子結構與三卡因相似，且末端有直接與載體蛋白偶聯的羧基，與載體偶聯后仍保留基本結構不變[18]，因此本研究以3-氨基苯甲酸為半抗原，利用三乙胺/氯甲酸異丁酯混合酸酐法把BSA和3-氨基苯甲酸偶聯制備3-氨基苯甲酸-BSA復合物，以此作為ELISA和試紙條T線的包被抗原。紫外吸收光譜結果(圖1-a)顯示，3-氨基苯甲酸在220～260及305 nm處有多個特征吸收峰，BSA則在280 nm附近有特征吸收峰，與BSA相比，3-氨基苯甲酸-BSA復合物在260～320 nm處的吸收峰較寬；與3-氨基苯甲酸相比，3-氨基苯甲酸-BSA復合物220～260 nm處的吸收峰形狀發生改變，由此可見，3-氨基苯甲酸-BSA復合物的這些紫外吸收峰改變可能是BSA和3-氨基苯甲酸的偶聯所致。為了進一步評價3-氨基苯甲酸-BSA是否偶聯成功，本研究以10 μg/mL 3-氨基苯甲酸-BSA作為包被抗原，采用三卡因的特異性單抗進行競爭性ELISA檢測，結果如圖1-b所示，呈現一個典型的“S”型競爭曲線，表明3-氨基苯甲酸-BSA與抗體間存在特異性反應，經計算抗體的IC50值為32.12 ng/mL。沈心怡[19]采用間接競爭ELISA方法評價丁香酚、三卡因抗體的質量，測得IC50值分別為42.844、43.399 ng/mL，證明抗體的靈敏度較高，且包被抗原與抗體之間具有較強的親和力和特異性。本研究得到的IC50較之更小，由此可見，合成的3-氨基苯甲酸-BSA抗原可用于免疫層析試紙條檢測。

a-紫外吸收光譜圖;b-競爭ELISA抑制曲線圖1 三卡因完全抗原的紫外吸收光譜和競爭ELISA曲線圖Fig.1 The UV absorption spectrum and competitive ELISA curve of tricaine complete antigen

2.2 基于磁性納米探針的三卡因層析檢測原理

三卡因的檢測試紙條結構如圖2所示，由樣品墊、結合墊、NC、吸水墊組成，T線包被3-氨基苯甲酸-BSA抗原，C線包被羊抗鼠IgG。若樣品中無三卡因時，磁納米探針與T線上的3-氨基苯甲酸-BSA抗原發生特異性反應從而停留在T線上，而C線上的羊抗鼠IgG和探針表面的三卡因單抗也存在特異性反應，因而試紙條的T線和C線都可以通過肉眼觀察到顏色，用磁信號儀檢測時可以看到T和C線處均有吸收峰，檢測結果為陰性(圖2，右上)。當樣品中三卡因濃度逐漸增加時，被T線捕獲的磁性納米探針則越來越少，T線顯色減弱，顏色越淺，相應的磁信號吸收峰變小(圖2，右下)，其檢測結果為陽性。

圖2 磁性免疫層析試紙條定量檢測三卡因的原理圖Fig.2 Schematic of magnetic immunochromatographic test strip for quantitative detection of tricaine

2.3 特異性

本研究選用了三卡因、布比卡因、苯佐卡因、利多卡因、丁香酚、苯氧乙醇、丙泊酚7種常見的漁用麻醉劑評價所開發試紙條的檢測特異性，檢測結果如圖3所示。由圖3-a可知，僅三卡因的檢測試紙條，在T線處的檢測限肉眼幾乎不可見，而丁香酚、布比卡因等其他6種麻醉劑的T線處顏色與陰性對照幾乎一致，表明磁性納米探針表面的三卡因單抗僅與三卡因有特異性反應，與其他麻醉劑無交叉反應。此外，依據試紙條的T線和C線的定量檢測結果，三卡因樣品的B/B0<0.2，為強陽性結果(圖3-b)；而其他6種麻醉劑的B/B0均大于0.9，與陰性樣品接近(圖3-b)，為陰性結果。由此可見，定量結果與定性觀察到的結果相吻合。三卡因與苯佐卡因互為同分異構體[20]，而本試紙條對苯佐卡因無交叉反應，表明該試紙條具有良好的特異性，檢測時不受其他漁用麻醉劑的干擾，具有較好的應用前景。

a-定性結果;b-定量結果圖3 三卡因試紙條特異性檢測Fig.3 SpeciffiIcity of tricaine test strip

2.4 靈敏度

采用三卡因試紙條分別檢測PBS和魚肉基質和水體中的三卡因標準品，其定性和定量檢測結果見圖4。由圖4可知，T線顏色隨著三卡因質量濃度的增加而逐漸變淺，當PBS緩沖液(圖4-a)、魚肉基質(圖4-b)和水體(圖4-c)中的三卡因質量濃度達到2.5 μg/mL (魚肉基質1.25 μg/g)時，T線顏色很淺，而5.0 μg/mL(魚肉基質2.5 μg/g)時則幾乎肉眼不可見。以T線消失時的質量濃度作為定性檢出限，因此魚肉基質5.0 μg/mL(相當于2.5 μg/g)可作為試紙條的定性檢出限。采用磁性免疫層析分析儀測定T、C線的磁信號強度，通過數據擬合表明，所建立的三卡因快速檢測方法對PBS緩沖液、魚肉基質、水體樣本的標準曲線如公式(2)～公式(4)所示:

(2)

(3)

(4)

式中：Y，檢測樣本的T/C線的磁信號比值與陰性對照的T線和C線的磁信號比值的比值(B/B0)；X，三卡因質量濃度，μg/mL。

根據B/B0值與三卡因加標濃度繪制標準曲線(圖4-d)，檢出限采用公式計算得出[21]。由圖4-d可知，3個曲線基本一致，表明魚肉基質對試紙條的檢測干擾較小。經計算，該試紙條對PBS稀釋三卡因的檢出限為0.131 μg/mL，對魚肉基質中三卡因的檢出限為0.150 μg/mL(相當于0.075 μg/g)，對水體中三卡因的檢出限為0.141 μg/mL，僅為美國FDA規定的水產品中三卡因最大殘留量(1 μg/mL)的1/6。

a-PBS緩沖液;b-魚肉基質;c-水體;d-定量標準曲線圖4 三卡因試紙條靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity of tricaine test strip

通常水產品運輸水體和魚肉基質中三卡因的濃度要遠遠大于該試紙條的檢出限，如王文豪等[22]研究發現適合麻醉大口黑鱸魚的三卡因劑量為70 mg/L，最適的運輸質量濃度為50 mg/L。李寧等[8]采用50 mg/L三卡因對大口黑鱸魚進行麻醉，發現復蘇8 h魚肉基質中三卡因殘留量高達36.24 mg/kg。盡管儀器分析法靈敏度高，由于耗時長、操作繁瑣、場地受限等問題難以滿足三卡因現場檢測需求。劉海新等[13]建立了魚肉中三卡因殘留的GC-MS檢測方法，方法檢出限為2.5 μg/kg，但魚肉樣品測定前需要經乙腈提取、氮吹濃縮、鹽酸溶液引導三卡因電離、固相萃取柱凈化等處理，從樣品處理到檢測完成所用時間大于3 h，操作繁瑣。劉春新等[23]建立了魚血和魚肝中三卡因的HPLC檢測方法，樣品經勻漿、高速離心、0.45 μm膜過濾處理后上樣檢測，使用魚血(稀釋倍數30 mg/mL)和魚肝(稀釋倍數30 mg/mL)勻漿液制備質量濃度為10、20、40、80、100 μg/mL的三卡因，成功建立了三卡因的工作標準曲線，但回收率較低，其中魚血中回收率低至80%，魚肝中回收率低至66.66%，說明基質效應對該方法的影響較大。而本研究建立的試紙條法，魚肉基質干擾較小，從樣品處理到檢測僅需約40 min，且操作簡單，無需大型儀器，成本低廉，適合于水產品中殘留三卡因的現場快速篩查和檢測。

2.5 準確性評價

分別采用三卡因試紙條和HPLC檢測三卡因人工污染水體和魚肉基質(n=3)，結果見表1。試紙法與HPLC對三卡因各濃度的檢測結果比較接近，表明試紙法與HPLC具有良好的一致性。試紙法對水體和魚肉基質中三卡因的加標回收率81.56%～113.59%，但是魚肉基質各樣品檢測值的CV值明顯高于水體組樣品，由此可見，在可接受范圍內魚肉基質對試紙條的檢測存在干擾。魚肉基質加標三卡因樣品5.0 μg/mL(相當于2.5 μg/g)的試紙條回收率最低，為(81.56±4.98)%，且樣本間的變異系數CV較高(6.1%)，表明檢測高濃度三卡因麻醉劑時，魚肉基質對試紙條的檢測結果干擾相對較大。HPLC分析方法因為其通過色譜柱分離富集，減少了基質帶來干擾。盡管儀器分析法準確性高，但在檢測效率上是遠遠低于試紙法。黎智廣等[24]采用HPLC-MS/MS檢測水產品中的三卡因，樣品需要提取、氮吹、過膜等前處理步驟，時長約3 h，樣品檢測還需15 min以上。本研究建立的試紙法樣品前處理操作簡單(約40 min)，可在5～10 min實現定性檢測，20 min實現準確定量檢測，大大縮短了檢測時間，且操作簡單，能夠有效提高檢測效率。

表1 試紙法與HPLC法對三卡因人工污染水體和魚樣的檢測結果Table 1 Test results of tricaine by test strip and HPLC in artificially contaminated water and fish samples

2.6 重現性和穩定性

三卡因試紙條的檢測重現性主要采用批內和批間實驗進行評價，本研究在檢測線性范圍內，以PBS為稀釋溶液，選擇了低、中、高加標濃度(0.5、1.0、5.0 μg/mL)進行試紙條檢測。由表2可知，來自同一批次(批內)及不同批次(批間)的試紙條對三卡因的檢測濃度與其加標濃度基本一致，不同濃度加標樣品對應的批內差異(CV<5%)略小于批間差異(CV<6%)，該結果與WANG等[25]對試紙條重現性檢測的結論一致。各濃度的同一批次檢測結果，其回收率為89.2%～112%，且變異系數較低(CV<5%)，表明本研究所構建的試紙條具有較好的重現性。采用高溫加速實驗對試紙條的穩定性進行分析，結果見表2，隨著高溫保存時間的延長，試紙條對低、中和高濃度三卡因的檢測結果并未發生明顯變化，試紙條在60 ℃保存5 d后，其B/B0的變異系數CV值仍小于8%，表明試紙條穩定性很好。徐曉巍等[26]基于磁納米探針構建了乙肝快速檢測試紙條，并進行了37 ℃高溫加速實驗檢測試紙條穩定性，結果表明，該試紙條可在37 ℃下穩定保存3周，相當于25 ℃下可保存半年。根據Arrhenius方程，試紙條在干燥環境下60 ℃貯存1 d相當于25 ℃貯存1個月[17]。由此推測該試紙條25 ℃下至少可保存5個月，將其密封保存至4 ℃下，可保存更長時間。

表2 試紙條重現性和穩定性檢測(n=5)Table 2 Reproducibility and stability test of tricaine test strip (n=5)

3 討論

三卡因是長途運輸活魚常用的一種漁用麻醉劑，盡管其應用于水產品麻醉中具有很大優勢，但被人體大量攝入后會對人體造成不良反應。據研究調查結果表明，水產品長途運輸過程中三卡因有效麻醉濃度較高、運輸時間(持續麻醉時間)較長，進而導致水產品中殘留有大量的三卡因。如陳永平等[27]對三卡因在草魚、花鱸、鯽魚組織中的富集和消除進行探究，采用50 mg/L的三卡因對質量約100 g的3種魚進行浸泡，發現浸泡3 h時三卡因在草魚血液、肌肉和肝胰臟的殘留量分別為2.341 μg/mL、1 275 μg/kg、2 130 μg/kg；花鱸魚中的殘留量分別為1.856 μg/mL、1 467 μg/kg、1 717 μg/kg；鯽魚中的殘留量分別為2.382 μg/mL、1 241 μg/kg、1 962 μg/kg。復蘇8 h后，草魚肌肉和肝胰臟殘留三卡因含量為120 μg/kg和482 μg/kg；花鱸魚中殘留量為244 μg/kg和334 μg/kg；鯽魚中殘留量為132 μg/kg和504 μg/kg。由此可見，復蘇后的魚體內還殘留有大量的三卡因，而本研究構建的三卡因快速檢測試紙條檢測限為75 μg/kg，可實現運輸水體中和魚肉組織中三卡因的快速篩查和初步分析，使相關部門快速了解麻醉劑污染情況。儀器檢測方法在檢測靈敏度上的確占有優勢，但對儀器設備和操作人員的技術能力依賴性較強，耗時長，所以不適用于漁業基層監管部門的現場監管。如表3所示，HPLC-MS/MS及GC-MS/MS等儀器方法是目前三卡因的主要檢測手段，其中，HPLC-MS/MS法的檢出限達1.0 μg/kg，但檢測時間大于90 min，且樣品的前處理需要經過提取、離心、旋轉蒸發、凈化等多次操作，過程較為復雜，無法滿足快速檢測的需求。GC-MS/MS法的檢出限達2.0 μg/kg，由于前處理需要經過重復提取、離心、凈化、氮吹、過膜等步驟，整個檢測時長大于120 min，這導致儀器分析無法應用于現場快速檢測。本研究利用磁性納米材料標記三卡因單抗，構建了可準確檢測魚肉基質和水體中三卡因的試紙條檢測方法，且水體無需進行特殊的前處理，只需肉眼觀察T線和C線的顏色即可在5～10 min 內實現三卡因的快速定性檢測，定量檢出限低至0.141 μg/mL，且操作簡單、成本低，可進行現場大規模檢測，采用本研究開發的試紙條檢測魚肉基質中三卡因，其結果為陽性表示魚肉中三卡因殘留量較高，污染程度較高，對監管部門具有示警作用。

4 結論

本研究將磁性納米探針與層析檢測技術相結合，建立了一種漁用麻醉劑三卡因的快速定性和定量檢測試紙條。該試紙條可在5～10 min內實現水體和魚肉基質中三卡因的定性檢測，其檢出限為0.141 μg/mL和0.150 μg/mL(相當于0.075 μg/g)，僅為美國對水產品中三卡因最大殘留量要求(1 μg/mL)的1/6，可對水產品在運輸過程中及出售前水體中的三卡因進行初步快速分析，對苯佐卡因、利多卡因、丁香酚、苯氧乙醇、丙泊酚等常見漁用麻醉劑無交叉反應，特異性高。此外，該試紙條具有較好的穩定性(25 ℃下可保存半年)，操作簡便，不僅為國內市場三卡因快速檢測試劑盒的缺乏提供參考價值，還實現了魚肉基質和水體中三卡因的現場快速篩查與檢測，為今后水產品及水體中三卡因的監控提供了技術支撐，保障鮮活水產品的質量安全。