超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定蜂王幼蟲中煙酰胺單核苷酸的含量

趙彤，趙洪木，宋美潔，杜偉，吳黎明，范芳芳，薛曉鋒*

1(中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京，100093)2(云南省農業(yè)科學院桑蠶蜜蜂研究所，云南 紅河哈尼族彝族自治州，661100) 3(安捷倫科技(中國)有限公司，北京，100102)4(老滇凰生命科學院，江蘇 蘇州，215000)

蜂王幼蟲，也稱蜂王胎，是蜜蜂受精卵消化吸收工蜂分泌的新鮮蜂王漿后生長而成的幼蟲，是蜂王漿加工的副產品，其凍干粉中含有約50%的粗蛋白和人體必須氨基酸，同時含有豐富的維生素、礦物質、生物活性酶等成分，具有極高的營養(yǎng)價值[1]。研究證實，蜂王幼蟲具有抗衰老[2]、抗氧化[3]、提高免疫力[4]等功效，作為一種昆蟲食品，其在保健和功能食品行業(yè)具有重要的開發(fā)應用價值和廣闊的市場前景。開展蜂王幼蟲功能組分挖掘及研究，對于促進蜂王幼蟲新資源功能性產品的開發(fā)與應用具有重要意義。

煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)合成的重要前體物質，其功能作用通過體內轉化為NAD+實現(xiàn)[5-6]，主要包括參與多種疾病的預防，如Ⅱ型糖尿病、肥胖癥和心力衰竭等，是醫(yī)藥、功能性食品、化妝品等行業(yè)的珍貴原料[7-9]。2016年，代謝領域研究最有影響的刊物《Cell Metabolism》報道給實驗鼠補充飼喂NMN可有效減輕小鼠與年齡相關的生理衰退，在沒有任何明顯毒性或有害影響的情況下，NMN可抑制與年齡相關的體重增加，可增強能量代謝，促進體力活動，改善胰島素敏感性和血脂水平，并改善眼功能和其他病理性疾病，證明了NMN在抗衰老方面的巨大潛力[9-10]。食品或功能產品中NMN的準確測定方法是監(jiān)測產品中NMN含量和評價其功能的關鍵。已有研究表明，蜂王幼蟲富含核苷酸類物質，而核苷酸類物質是蜂王幼蟲正常生長發(fā)育的必要物質之一[11]，但尚無關于蜂王幼蟲中NMN的研究報道。

因此，為了快速準確測定蜂王幼蟲中NMN的含量，本文優(yōu)化了NMN的提取方法，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(ultra-high performance liquid chromatographic tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS)測定蜂王幼蟲中NMN的分析方法。應用方法測定實際蜂王幼蟲樣品中NMN的含量，并研究其在不同貯存條件下的穩(wěn)定性，以期為蜂王幼蟲NMN含量分析和功能應用，以及蜂王幼蟲產品的質量控制提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1 mL離心管、50 mL離心管，康寧生命科學(吳江)有限公司；甲酸銨、甲酸，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；乙醇、甲醇：色譜純，美國MREDA公司；蜂王幼蟲LDH1和蜂王幼蟲LDH2、蜂王幼蟲凍干粉LDH-P1，老滇凰原料基地蜂場；其他幼蟲樣品S1～S9，浙江蜂場隨機取樣；煙酰胺單核苷酸標準品：純度>95%，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

6495 Agilent超高效液相色譜串聯(lián)質譜儀，美國Agilent公司；高速離心機，湖南湘儀有限公司；渦旋混勻器，美國Scientific Industries公司；十萬分之一分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準工作溶液的配制

精密稱取NMN標準品適量，用蒸餾水配成1 mg/mL的標準儲備液。將儲備液稀釋成質量濃度分別為50、100、250、500和1 000 ng/mL的標準工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取新鮮蜂王幼蟲樣品5 g或凍干粉1 g于50 mL 離心管中，加入15 mL乙醇，渦旋混合2 min，后加入15 mL蒸餾水，渦旋混合5 min，轉移至50 mL容量瓶，蒸餾水定容。取出適量溶液，在8 000 r/min離心4 min，取上清液用蒸餾水稀釋至原質量濃度的1/50，后經0.22 μm尼龍濾膜過濾，待上機檢測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Waters X Select HSS T3(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)；流動相A為5 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.4%甲酸，體積分數(shù))，流動相B為甲醇；洗脫程序：0～3 min，0% B；3～4 min，0% B～90% B；4～8 min，90% B；8～10 min， 90% B～0% B；柱溫：40 ℃，進樣量：1 μL，流速：0.2 mL/min。

1.3.4 質譜條件

離子源：離子漏斗，電噴霧離子源(electron spray ionization，ESI)，正離子模式；掃描方式：多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)；干燥氣溫度220 ℃；干燥氣流速15 L/min；霧化器壓力40 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速12 L/min；毛細管電壓3 500 V；噴嘴電壓500 V。

1.3.5 蜂王幼蟲中NMN的穩(wěn)定性研究

用1.3.2的提取方法、1.3.3的色譜條件和1.3.4的質譜條件，測定-18、4 ℃和常溫條件下貯存0、1、2、3、4、5、6、7 d的蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中NMN的含量。

2 結果與分析

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

蜂王幼蟲中含有大量的蛋白質，會影響NMN的提取和測定，因此，在提取NMN前，需先進行蛋白質的沉淀。本實驗分別對比了甲醇、乙醇和乙腈對蛋白質沉淀能力，結果表明，乙醇可以有效沉淀蜂王幼蟲樣品中的蛋白質。圖1展示了NMN的結構式，可見其分子中包含2個裸露的—OH，親水性強，因此，選擇水為NMN的提取溶劑最合適。另外，通過比較實驗發(fā)現(xiàn)當乙醇和水的體積比為1∶1時，沉淀蛋白和提取效果最佳。實際樣品中NMN含量較高，在上機分析前需要將提取液進一步稀釋(1/50～1/100)倍，此步驟可以明顯降低基質影響，實現(xiàn)樣品中NMN的準確測定。

圖1 NMN的結構式Fig.1 The chemical structural of NMN

2.2 色譜與質譜條件的優(yōu)化

為優(yōu)化分離，本實驗對比了不同體積分數(shù)甲酸銨水溶液、甲酸-甲酸銨水溶液、不同體積比的甲醇、乙腈組成的流動相以及4種色譜柱：Agilent Infinitylab Poroshell 120 HILIC-Z(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)(下文簡稱HILIC-Z)、Halo AQ-C18(2.1 mm×50 mm, 2 μm)(下文簡稱AQ-C18)、Agilent Infinitylab Poroshell 120 HILIC-OH5(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)(下文簡稱HILIC-OH5)和Waters X Select HSS T3(2.1 mm×100 mm, 2.5 μm)(下文簡稱HSS T3)的分離效果，根據NMN的分離度、響應值和色譜峰型，選擇最佳的分離條件。結果發(fā)現(xiàn)，水相中加入甲酸和甲酸銨，不僅能提高NMN的響應值，還能改善峰型，甲醇為流動相時響應比乙腈更高。HILIC-Z分離時，峰型較差，AQ-C18和HILIC-OH5對NMN的保留能力弱，且與基質無法有效分離，HSS T3分離時，峰型尖銳對稱，無拖尾現(xiàn)象。因此，選擇含0.4%甲酸的5 mmol/L甲酸銨水溶液-甲醇溶液為流動相，選擇HSS T3為分離色譜柱。圖2為NMN標準溶液的色譜圖。

圖2 NMN標準溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of the NMN standard solution

NMN結構上包含1個伯胺，容易生成[M+H]+離子，故選擇電噴霧正離子(ESI+)掃描方式，根據[M+H]+離子找到準分子離子峰，進一步對NMN的[M+H]+離子進行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量、駐留時間及離子加速電壓，在MRM模式下選取響應高，離子比穩(wěn)定的離子作為監(jiān)測離子對，優(yōu)化得到離子對與文獻報道一致[12]，可以滿足NMN的準確定性和定量。具體質譜條件優(yōu)化結果見表1。

表1 NMN的保留時間及質譜分析條件Table 1 Retention time of NMN and its MS/MS acquisition settings

2.3 線性范圍、檢出限(limits of detection，LOD)、定量限(limits of quantitation，LOQ)

采用優(yōu)化后的參數(shù)進行UHPLC-MS/MS方法學研究，以NMN的峰面積為縱坐標(Y)，對應質量濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，結果表明，NMN標準品在50～1 000 ng/mL呈現(xiàn)良好的線性關系。根據信噪比確定LOD(S/N=3)以及LOQ(S/N=10)分別為11.2 μg/kg和37.4 μg/kg。

2.4 NMN提取液穩(wěn)定性實驗

稱取樣品，用1.3.2的方法制備提取液，按照1.3.3的色譜條件和1.3.4的質譜條件，分別在0、3、6、18、24 h測定NMN的含量，并計算降解率，測定結果見表2。

表2 提取液的降解率 單位：%

結果表明，NMN提取液在24 h 后的降解率為4.87%，供試樣品溶液在24 h內穩(wěn)定，樣品在提取完成后應在24 h內測定完成。

2.5 回收率實驗

由表3可知，在20、40和80 μg/g 3個添加水平下，NMN的添加回收率在109.9%～111.2%，RSD在0.87%～3.31%，說明建立的方法具有很好的準確度和精密度，可以滿足蜂王幼蟲中NMN的準確測定。

表3 NMN加標回收率Table 3 Standard recovery of NMN

2.6 實際樣品含量測定

按照上述優(yōu)化方法對蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉進行檢測，圖3為樣品的總離子流圖(total ion chromatography，TIC)，圖4為樣品中NMN的MRM圖譜。蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中NMN的含量見表4。

圖3 樣品的TIC圖Fig.3 TIC chromatogram of sample

圖4 樣品中NMN的MRM圖譜Fig.4 MRM chromatogram of NMN in sample

表4 蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中NMN含量Table 4 NMN content of queen bee larva and frozen dry powder of queen bee larva

由表4可知，蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中均含有NMN。其中，蜂王幼蟲凍干粉中NMN含量更高，為78.0 μg/g，LDH1和LDH2樣品(試驗蜂場)中NMN含量分別為65.8 μg/g和62.5 μg/g，隨機蜂場采集的樣品S1～S9中NMN的含量為37.0～49.0 μg/g。蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉樣品中NMN的含量差異可能與蜂種、飼養(yǎng)方式、飼料類型以及幼蟲的采集和貯存條件相關。

與文獻報道的其他食品中NMN含量(0.1～3.3 μg/g)相比[13]，蜂王幼蟲中NMN的含量高出普通食品10～80倍，可以作為補充NMN的食品或功能產品資源。此外，NMN可能對蜂王幼蟲正常發(fā)育起重要作用[14]，其含量也可能影響蜂王健康和壽命，相關的研究還需要進一步開展。

2.7 蜂王幼蟲NMN的穩(wěn)定性測定

為確定蜂王幼蟲中NMN在貯存期內的降解情況，分別于0、1、2、3、4、5、6、7 d，測定-18、4 ℃和常溫條件貯存的蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉中NMN含量，結果見表5。

表5 蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉在不同貯存條件下 NMN的降解率Table 5 NMN degradation rate of queen bee larva and frozen dry powder of queen bee larva with different storage condition

由表5可知，蜂王幼蟲在常溫保存時，隨著時間的延長NMN出現(xiàn)快速降解，在第7天降解率達到96.4%；在4 ℃保存時，降解速率較常溫要慢，但在第7天仍可達到了88.5%；在-18 ℃保存時，蜂王幼蟲中的NMN在7 d內未降解。蜂王幼蟲凍干粉在常溫、4和-18 ℃保存，7 d內均未降解。說明常溫和非冷凍條件(4 ℃)不利于蜂王幼蟲中NMN的保存，低溫或凍干可有效控制蜂王幼蟲中NMN的降解。蜂王幼蟲中NMN的降解可能與NMN腺苷酰轉移酶的作用有關，在適當條件下，將NMN轉化為NAD。凍干粉或-18 ℃低溫保存可以抑制蜂王幼蟲中的腺苷酰轉移酶發(fā)揮作用，從而使其無法將NMN轉化為NAD。已有研究報道，由于NAD的分子質量較大，無法通過口服攝取至細胞內，而NMN可有效補償隨年齡增長帶來的體內NAD含量下降[9]。合理的保存和加工方法可保護蜂王幼蟲中NMN不被降解，對于保持蜂王幼蟲及其產品的品質和功能活性具有重要意義。

穩(wěn)定性實驗發(fā)現(xiàn)，蜂王幼蟲NMN極易降解，所以在采集蜂王幼蟲樣品后，應該將其及時冷凍或制成凍干粉以減少NMN的降解。作為重要的功能組分，NMN也可以作為蜂王幼蟲及其產品新鮮度和品質評價的潛在指標。

3 結論

論文通過優(yōu)化蜂王幼蟲中NMN的提取方法和分析條件，建立了UHPLC-MS/MS方法，并對蜂王幼蟲及其凍干粉樣品中NMN的含量進行測定。方法快速簡單，靈敏度高，在3個質量濃度添加水平下，平均回收率為109.9%～111.2%，方法的RSD為0.87%～3.31%，可以實現(xiàn)蜂王幼蟲中NMN的準確測定。應用建立的方法，測定了蜂王幼蟲和蜂王幼蟲凍干粉樣品中NMN的含量，并連續(xù)測定7 d不同貯存條件下NMN的含量變化。實際樣品中均檢出NMN，新鮮蜂王幼蟲的NMN含量為37.0～65.8 μg/g，蜂王幼蟲凍干粉中NMN的含量為78.0 μg/g。與文獻報道其他產品相比，蜂王幼蟲中NMN含量遠高于其他常見的食品，可以作為重要的NMN補充食物來源。貯存試驗結果顯示，在常溫或4 ℃條件下，蜂王幼蟲中的NMN快速降解，蜂王幼蟲樣品應該在采集后-18 ℃冷凍貯存或加工為蜂王幼蟲凍干粉，以有效保護NMN不被降解。作為重要的功能成分，NMN也可作為蜂王幼蟲及其產品的功能性或新鮮度的潛在評價指標，用于產品的質量控制。本研究建立的方法也為蜂王幼蟲產品的進一步開發(fā)利用以及NMN在蜂王發(fā)育過程中的作用研究提供重要的技術支撐。