牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的熱負荷特征肽段篩選及其含量隨加熱溫度的變化規律

許博舟，王秀娟,*，胡玲玲，李 潔

（1.中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所，北京 100176；2.杭州璞湃科技有限公司，浙江 杭州 310051；3.中國醫科大學藥學院，遼寧 沈陽 110122）

牛乳營養價值高，含有豐富的蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質，易于被人體消化吸收，是理想的天然食品之一。但生鮮乳容易受到病原微生物的污染，也是微生物生長繁殖的絕佳介質。因此，生鮮乳需經過熱加工處理殺滅微生物，才能確保安全飲用。

市售牛乳按其熱加工處理殺菌工藝可分為兩大類，包括巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳。超高溫滅菌乳經過超高溫瞬時滅菌（135～150 ℃、4～15 s）處理，完全破壞其中可生長的微生物和芽孢，牛乳中無微生物存在，因此可在常溫下保存，且保質期比較長，一般可達3～6個月。但是高溫會損害牛乳中B族維生素、VC等營養元素，對風味和口感也有影響。而對牛乳采用較低溫的巴氏殺菌法進行熱處理，溫度一般為72～85 ℃[1]，這一方法可殺死生鮮乳中各種生長型致病菌，僅殘留部分嗜熱菌及其芽孢等，這些多數是對人體有益的乳酸菌。因此，巴氏殺菌乳既能夠達到安全飲用標準，又能最大程度地保留生鮮乳的營養和風味。但巴氏殺菌乳的貨架期較短，一般為7～12 d，且需要在2～6 ℃的低溫條件下保存，不利于長時間貯存，且運輸、加工和保存成本較高。除此之外，乳品企業推出的一款介于傳統巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳之間的產品üü延長貨架期（extended shelf life，ESL）牛乳，近些年在市場廣受歡迎，該類產品的標簽貨架期在低溫保存條件下為21～24 d[2-3]，遠長于傳統巴氏殺菌乳10 d左右的貨架期。相關文獻中報道，該類產品是采用較傳統巴氏殺菌乳更高的殺菌溫度進行短時間殺菌（120 ℃、2～4 s），從而實現產品的較長貨架期[3]。而乳品企業則表示，該類產品是通過改進加熱工藝和提高灌裝設備等級實現的更高效的殺菌。ESL牛乳因滿足消費者對保質期和牛乳新鮮度的要求，而在德國、奧地利等歐洲國家和地區的市場上廣受歡迎[4]，但目前，上述歐洲國家和我國對此類產品的加熱工藝、殺菌溫度等并沒有明確的規定，也沒有有效的鑒別方法[3]。

研究表明當生鮮乳受熱時，會發生如磷酸鈣的沉淀、美拉德反應和酪蛋白顆粒化等一系列變化，影響口感并導致營養損失。通常情況下，一些在未經熱處理的牛乳中不存在的，或僅痕量存在的物質，因其較好的穩定性，便于含量測定，通常被用來表示高溫熱處理過程的熱損傷程度[5]。例如糠氨酸、乳果糖、賴丙氨酸、5-羥甲基糠醛等常被用作判斷食品受熱程度的指標，在谷物、蛋類、肉制品、乳制品中均有應用[6-8]，但此類物質無法指示較低溫度或較低溫度變化下牛乳的熱處理強度[9-10]。乳清蛋白是生鮮乳中對熱最為敏感的蛋白質，是指溶解分散在乳清中的蛋白質，其在相對較低的溫度下，也易發生變性[11-12]，在生鮮乳熱加工過程中，當溫度超過了其耐受溫度，其結構、生物活性和溶解度都會發生變化[12-14]，即蛋白質熱變性。研究表明，當牛乳的加工條件為77.5 ℃加熱60 min或90 ℃加熱5 min時，其中的乳清蛋白會徹底變性[15]。Boitz等[16]研究發現巴氏殺菌乳中乳清蛋白變性率約10%～20%，超高溫滅菌乳乳清蛋白變性率則高達40%～60%。由于熱加工的溫度和時間是影響乳清蛋白變性的重要因素，且乳清蛋白的質量分數與熱處理的強度呈反比[15]，本研究選用熱不穩定的物質üü乳清蛋白，作為牛乳熱處理過程標志物，根據乳清蛋白的質量分數評估生鮮乳中蛋白質變性程度，從而判定牛乳熱處理工藝。

α-乳白蛋白（25%）和β-乳球蛋白（55%）在牛乳清蛋白中占比約80%，其在牛乳中總蛋白質占比超過20%[16-17]。研究發現，由于Ca2+的存在，當加熱溫度到達60 ℃或者pH值高于8.6時，β-乳球蛋白開始發生變性[18-19]，當加熱溫度到達66 ℃，α-乳白蛋白開始發生變性[20]。在120 ℃加熱80 s、130 ℃加熱40 s、140 ℃加熱30 s條件下，β-乳球蛋白會徹底變性[21]。國際乳品聯合會（International Dairy Federation，IDF）評估不同加熱條件下液態乳中β-乳球蛋白的最低含量，在巴氏殺菌乳、高溫巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳中分別為2 600、2 000 mg/L和50 mg/L[22]。目前的研究可通過乳清蛋白質含量確定牛乳中蛋白質變性溫度，但無法表示隨熱處理溫度的變化牛乳的熱損傷程度。因此，本研究以牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白作為目標物，篩選出其經熱處理后的蛋白質熱負荷特征肽段，通過超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）進行測定，依據篩選出的熱負荷特征肽段含量判斷牛乳的熱損傷程度，并通過熱負荷特征肽段含量指示牛乳熱處理溫度，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）模型，區分不同加熱溫度的牛乳，從而實現不同熱處理方式牛乳的鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT，純度≥99.0%）、碘乙酰胺（iodocaetamide，IAA，純度≥99.0%）美國Sigma公司；胰蛋白酶（蛋白質量分數≥50.0%）美國Promega公司；甲酸、乙腈（均為色譜純）美國賽爾科技公司；碳酸氫銨為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Q Exactive組合型四極桿Orbitrap質譜儀（配有電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）、Proteome Discoverer 2.2數據處理軟件） 美國Thermo Fisher公司；ACQUITY UPLC Xevo TQ超高效液相色譜-串聯質譜儀 美國Waters公司；實驗型殺菌機 中國上海輝展實驗設備有限公司；恒溫混勻儀 中國杭州奧盛儀器有限公司；Milli-Q Advantage A10純水系統 德國Merck Millipore公司；Vortex Genie 2渦旋振蕩器 美國Vortex公司；KQ-500DE超聲波清洗器 中國昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

在牧場分20 批次采集生鮮乳樣品，為避免個體樣品差異，將采集的全部樣品充分混勻，取10 L備用。采集市售牛乳樣品16 例，包括巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳和ESL牛乳，記錄其品牌、包裝、殺菌工藝、貨架期、建議保存溫度等信息。

1.3.2 標準樣品制備

α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標準品，為獲得經高溫熱處理后的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的熱負荷特征肽段，將乳清蛋白粉充分熱處理至120 ℃，持續2 min，至α-乳白蛋白和β-乳球蛋白徹底變性，獲得嚴重糖基化的乳清蛋白粉，備用。

1.3.3 熱處理

將10 L生鮮乳樣品冷卻至4 ℃后，注入實驗型殺菌機，緩慢加熱至50 ℃，以每10 ℃為1 級變化梯度，從50 ℃加熱到150 ℃，每級變化梯度保持加熱時間5 s。當達到加熱溫度和時間，依次接出已加熱的牛乳樣品，待樣品冷卻至室溫后密封貯存于-80 ℃。11 級不同加熱溫度梯度（50～150 ℃）的樣品依次制備完成，備用。

1.3.4 多肽的測定

1.3.4.1 前處理

取1 g待測樣品，用水稀釋至10 mL，渦旋混勻，超聲10 min，取200 μL稀釋液至2 mL塑料離心管中，加入200 μL 500 mmol/L碳酸氫銨溶液溶解，渦旋混勻，加入10 μL 500 mmol/L DTT溶液，至于50 ℃溫箱中30 min，取出放至室溫，加入30 μL 500 mmol/L IAA溶液，避光靜置30 min，加入1 mg/mL 20 μL胰蛋白酶，至于恒溫混勻儀中37 ℃酶解過夜，取出放至室溫，加入10 μL純甲酸終止酶解反應，避光靜置15 min，用水定容至1 mL，過0.22 μm水相濾膜，待測。

1.3.4.2 儀器條件

參照文獻[11,23]前處理及其UPLC-MS/MS方法。Waters ACQUITY UPLC Peptide BEH C18色譜柱（2.1 mmh100 mm，1.7 μm）；流動相：A為0.1%甲酸溶液和B為0.1%甲酸-乙腈溶液；進樣量1 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

依據α-乳白蛋白和β-乳球蛋白經胰蛋白酶的酶解方式，在嚴重糖基化的乳清蛋白粉中，篩選出的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的熱負荷特征肽段，編號1#～6#，通過UPLC-MS/MS在ESI+模式下采用電噴霧電離多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進行含量測定，質譜參數如表2所示。

表2 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白熱負荷特征肽段質譜參數Table 2 Mass spectrometric conditions for analysis of signature peptides from α-lactalbumin and β-lactoglobulin

1.4 數據處理

為考察熱處理溫度對熱負荷特征肽段（肽段1#～6#）含量的影響，每批樣品進行2個水平的平行實驗，通過對比不同加熱溫度條件下熱負荷特征肽段定量離子峰強度，采用Minitab 17.0數據分析軟件，單因素方差分析研究加熱溫度對樣品中熱負荷特征肽段離子峰強度值的影響，P＜0.05，差異顯著，P＜0.01，差異極顯著。

SIMCA-P 14.1（瑞典Umetrics公司）軟件用于建立PCA模型，采用交叉驗證方差分析對模型的可靠性進行驗證，Q2及R2的值越接近于1，模型的鑒別效果越可靠且優異，其中Q2＞0.5時，模型即被認可具有良好預測能力，可通過以上分析和模型，鑒別市售巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳。

2 結果與分析

2.1 熱處理前α-乳白蛋白和β-乳球蛋白特征肽段選擇

選擇熱處理前的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白特征肽段是準確測定目標蛋白質含量的關鍵。本研究通過在線計算預測工具PetptideMass（https://web.expasy.org/peptide_mass/），在UniProt數據庫中搜索α-乳白蛋白和β-乳球蛋白氨基酸序列，以及理論上被胰蛋白酶切割得到的特征肽段。采用堿性胰蛋白酶作為酶切工具，利用其特異性，水解精氨酸（R）與賴氨酸（K）羧基端的肽鍵，將乳清蛋白粉中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白酶切形成肽段[24]。根據其酶解方式，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在R、K位點酶切，見圖1，分別獲得9 條和13 條長短不一的多肽。由于氨基酸數少于6個的肽段特異性不強，氨基酸數大于12個的肽段色譜分辨率較低[25]，考慮到測定的準確度和穩定性，故選擇6～12個氨基酸的多肽作為目標肽段進行分析。通過對多肽的離子豐度評估，經篩選，α-乳白蛋白的2 條肽段LDQWLCEK、VGINYWLAHK，β-乳球蛋白的4 條肽段IPAVFK、TPEDDEALEK、VLVLDTDYK、IDALNENK符合檢測要求，可作為α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特征肽段。

圖1 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白A/B氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequences of α-lactalbumin and β-lactoglobulin A/B

2.2 熱處理后α-乳白蛋白和β-乳球蛋白熱負荷特征肽段確定

為獲得牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的熱負荷特征肽段，本研究制備了嚴重糖基化的乳清蛋白粉，經胰蛋白酶酶切獲得的肽段，與未經熱處理的乳清蛋白粉酶切獲得的IPAVFK、TPEDDEALEK等特征肽段對比，通過Q Exactive組合型四極桿Orbitrap質譜儀采集信息，將結果導入至Proteome Discoverer 2.2軟件中，獲得如TKIPAVFK、LDQWLCEKL等10 條熱負荷特征肽段。由于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白熱變性的本質是蛋白結構的去折疊化，三級結構被破壞，分子內部的二硫鍵被暴露出來，形成改性單體蛋白。熱處理后，糖基化過程使α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的氨基酸序列中R或K位點處修飾單糖，導致胰蛋白酶無法在已修飾單糖的R、K位點酶切。因此，生鮮乳經熱處理后，再經胰蛋白酶酶切獲得的肽段發生變化，10 條特征肽段熱處理前后對比表詳見表3。通過UPLC-MS/MS對10 條熱負荷特征肽段逐一掃描，對比離子保留時間、峰面積、峰形、離子比率等條件，考慮測定的準確度和穩定性，本研究篩選出6 條符合要求的熱負荷特征肽段，并采集其離子信息，定量離子色譜圖見圖2，對6 條熱負荷特征肽段進行編號，即肽段1#～6#，見表2。熱處理程度越強，熱負荷特征肽段含量越高，相應的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白中熱處理前特征肽段含量越低。

圖2 肽段1#～6#定量離子MRM譜圖Fig.2 Quantitative ion MRM chromatograms of peptides 1#–6#

表3 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白特征肽段熱處理前后對比Table 3 Signature peptides from α-lactalbumin and β-lactoglobulin before and after thermal treatments

2.3 熱負荷特征肽段含量隨熱處理溫度的變化規律

為考察牛乳熱處理過程中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的熱負荷特征肽段含量與加熱溫度的關系，將制備完成的11 級不同加熱溫度梯度（50～150 ℃）的牛乳樣品進行熱負荷特征肽段的定量離子峰強度分析。熱負荷特征肽段離子峰強度值表示熱負荷特征肽段在樣品中的含量，熱負荷特征肽段含量與蛋白變性程度有關。肽段1#、2#、4#～6#在100 ℃以下加熱的牛乳樣品中離子峰強度較低，當加熱溫度達到100 ℃時，離子峰強度顯著提高，見圖3，與加熱溫度100 ℃以下的樣品具有明顯差異（P＜0.05）。相關文獻中報道α-乳白蛋白和β-乳球蛋白其變性溫度為96 ℃[26]，與本實驗結果基本相同，說明蛋白質變性程度和本研究篩選出的熱負荷特征肽段含量存在相關性。

牛乳樣品在熱處理溫度低于100 ℃時，肽段2#、5#（β-乳球蛋白熱負荷特征肽段）的離子峰強度值均低于15 000，熱處理溫度在100～130 ℃時，肽段2#、5#的離子峰強度值明顯升高，當熱處理溫度高于130 ℃，肽段2#、5#的離子峰強度值不再升高，見圖3。說明隨著熱處理溫度升高和時間延長，肽段2#、5#的含量增加，130 ℃后，乳清蛋白完全變性，樣品中熱負荷特征肽段含量不再變化。有研究對牛乳的熱處理研究，在60～120 ℃條件下，其變性程度與熱敏指標糠氨酸、乳果糖含量均存在很強的相關性（R2＞0.99）[27-28]。因此β-乳球蛋白的變性程度與溫度有關，篩選出的肽段2#、5#也可作為熱處理的指示物，其含量隨熱處理溫度升高和時間延長而增加。

隨著熱處理溫度升高和時間延長，肽段3#（α-乳白蛋白熱負荷特征肽段）的離子峰強度值增加，在熱處理溫度為60～80 ℃時，離子峰強度值明顯增加，如圖3所示。參考相關研究[20,28]，α-乳白蛋白的熱力學轉變溫度為66 ℃，即在66 ℃時有部分發生變性。與本實驗結果顯示一致，說明α-乳白蛋白的熱負荷特征肽段3#也可作為牛乳熱處理過程的指示物。當牛乳熱處理溫度超過80 ℃時，肽段3#離子峰強度值明顯高于低溫加熱牛乳。采用巴氏殺菌法加工而成的牛乳，特點是采用72～85 ℃左右的低溫殺菌[1]，因此，牛乳中熱負荷特征肽段3#的含量高低可用于鑒別巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳。

圖3 熱處理溫度對肽段1#～6#離子峰強度的影響Fig.3 Effect of heating temperature on the ion peak intensity of peptides 1#–6#

2.4 PCA模型建立

采集市售牛乳樣品16 例，包括8 例巴氏殺菌乳（1～8號）和8 例超高溫滅菌乳（9～16號），采用已建立的UPLC-MS/MS方法對樣品中的肽段1#～6#進行含量測定，每例樣品2 組平行實驗，采集獲得定量離子峰強度信息。將數據預處理后導入SIMCA-P 14.1中，進行PCA模型擬合，以熱負荷特征肽段離子峰強度值和熱處理方式作為響應變量，采用交叉驗證方差分析對模型進行驗證，理論上，Q2和R2越接近1說明模型可靠性越強[29]。由于進行巴氏殺菌法的加熱溫度一般為72～85 ℃[1]，超高溫滅菌法的溫度為135～150 ℃，當熱加工溫度超過100 ℃時，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白糖基化程度明顯加劇，導致肽段1#～6#的離子峰強度值存在明顯差異，得到結果Q2=0.947，R2=0.967，見圖4。因此，該分析模型可靠。

圖4 市售牛乳樣品PCA模型分析Fig.4 PCA plot of commercial milk samples

2.5 巴氏殺菌乳與超高溫滅菌乳的鑒別

不同熱處理的市售牛乳樣品中肽段1#～6#的離子峰強度值均差異極顯著（P＜0.01）。其中，肽段1#、2#、5#、6#（β-乳球蛋白熱負荷特征肽段）在巴氏殺菌乳中的離子峰強度值分別低于1 100、10 000、7 500、6 400，在超高溫滅菌乳中均超過2 800、30 000、15 000和15 000。肽段3#和肽段4#（α-乳白蛋白熱負荷特征肽段）在巴氏殺菌乳中的離子峰強度值分別低于450和1 800，在超高溫滅菌乳中均超過2 700和2 800，見圖5。鑒此可采用PCA模型和肽段1#～6#的離子峰強度值，初步實現巴氏殺菌乳與超高溫滅菌乳的鑒別。

圖5 市售巴氏殺菌乳（A）和超高溫滅菌乳（B）中肽段1#～6#的離子峰強度值比較Fig.5 Comparison of ion peak intensity of peptides 1#–6# incommercial pasteurized milk (A) and UHT milk (B)

除此之外，研究還發現，6號和7號樣品中肽段2#和肽段5#（β-乳球蛋白熱負荷特征肽段）的離子峰強度值高于其他隨機采集的市售巴氏殺菌乳樣品，但仍與超高溫滅菌乳差異極顯著（P＜0.01），見圖5。此2 例樣品標識為巴氏殺菌乳，且要求2～6 ℃低溫保存，貨架期分別為15 d和21 d，明顯高于同類巴氏殺菌乳產品7～15 d的貨架期。依據本研究結果，隨著加熱溫度的變化，蛋白質糖基化程度逐漸明顯，β-乳球蛋白的熱負荷特征肽段含量逐漸增加，熱處理前特征肽段含量逐漸減少。該結果與IDF評估過的不同加熱條件下液態乳中的β-乳球蛋白的含量關系基本一致，為巴氏殺菌乳高于高溫巴氏殺菌乳，高于超高溫滅菌乳[22]。前期調研結果顯示，部分廠家應用創新的熱加工技術延長牛乳的貨架期，結合實驗分析結果，乳品企業應用了高溫巴氏殺菌工藝，雖然延長了產品貨架期，但較普通巴氏殺菌乳，糖基化程度增加，對鮮牛乳的營養和風味會造成一定影響。

3 結 論

熱處理過程會導致牛乳中乳清蛋白糖基化，影響牛乳的風味與口感。本研究以α-乳白蛋白和β-乳球蛋白作為牛乳熱處理標志物，依據胰蛋白酶酶切規律，運用Proteome Discoverer 2.2軟件，篩選出α-乳白蛋白和β-乳球蛋白中共6 條熱負荷特征肽段，采用UPLC-MS/MS測定其在不同加熱溫度下的含量變化，結果表明，熱負荷特征肽段含量可用來指示熱處理溫度，隨熱處理溫度的升高而增加。通過測定市售牛乳樣品中熱負荷特征肽段的含量，基于食品組學技術，建立的PCA模型實現了巴氏殺菌乳與超高溫滅菌乳的鑒別。在乳制品生產中，可通過α-乳白蛋白糖和β-乳球蛋白熱負荷特征肽段的含量，較準確的控制加熱條件，從而達到例如降低乳的致敏性、改善酸凝乳的凝膠特性等不同的需求。