四妙四逆散治療慢性宮頸炎作用機制探討*

佘序華，馮麗平，黃玉梅，秦繼勝

廣西桂林市中西醫結合醫院 廣西桂林 541004

慢性宮頸炎（chronic cervicitis，CC）是臨床常見的女性生殖道炎癥性疾病，其病理表現是宮頸間質中大量炎癥細胞的浸潤，最常見的局部病理特征是宮頸糜爛，以陰道分泌物增多、接觸性出血、腰骶部疼痛等為主要癥狀表現[1-3]。慢性宮頸炎屬于中醫學帶下病范疇，本文所研究的四妙四逆散是根據其濕熱下注的基本病機所創制的臨床有效經驗方[4-5]，由柴胡、黃柏、白芍、蒼術、枳實、薏苡仁、牛膝、甘草八味中藥組成，具有清熱利濕止帶，疏肝解郁理氣功效，廣泛運用于慢性宮頸炎的臨床治療，具有抑制病原體感染，促進炎癥因子的吸收，改善微循環，增強自身免疫調節等作用。本研究為進一步探究四妙四逆散治療慢性宮頸炎的潛在機制，采用網絡藥理學方法及分子對接技術探討其核心化合物及核心靶點的相互作用，為四妙四逆散的臨床應用提供依據。

材料與方法

1 篩選四妙四逆散的有效化合物及靶點

運用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（http://tcmspw.com/tcmsp.php）篩選四妙四逆散中符合口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18的有效化合物，并通過進行靶點注釋。

2 篩選四妙四逆散治療慢性宮頸炎的作用靶點及化合物

通 過GeneCards數 據 庫（https：//www.genecards. org）檢索“chronic cervicitis”相關的疾病靶點，在Venny軟件中導入四妙四逆散的有效靶點及慢性宮頸炎的疾病靶點并篩選交集基因，獲得作用靶點。

3 構建四妙四逆散治療慢性宮頸炎的中藥-化合物-靶點網絡

在Cytoscape 3.8.2軟件導入作用靶點和化合物，構建四妙四逆散治療慢性宮頸炎的“中藥-化合物-靶點”網絡并對該網絡進行核心成分分析。選擇高連接度的化合物作為核心成分。

4 構建蛋白質相互作用網絡及拓撲網絡

在Cytoscape 3.8.2軟件導入作用靶點，選擇Between Centrality、Closeness Centrality、Degree Centrality進行分析，構建拓撲網絡并篩選樞紐靶點。在String數據庫（http://string-db.org）導入作用靶點，構建蛋白質互作網絡，篩選核心靶點。

5 四妙四逆散治療慢性宮頸炎的GO和KEGG富集分析

使用DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）和KEGG（https://www.kegg.jp/）對四妙四逆散治療慢性宮頸炎的靶點進行基因本體論和KEGG富集分析和可視化。

6 四妙四逆散治療慢性宮頸炎的核心靶點與成分的分子對接

在PDB數據庫（http://www.rcsb.org/）及pubchem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載核心靶點及成分結構，運用AutoDock軟件進行去水、加氫及計算電荷處理后以蛋白自帶配體為中心構建對接口袋，并進行分子對接計算結合能分值。最后選擇對接分值最佳的受體-配體結構進行繪圖。

結 果

1 四妙四逆散的有效化合物及靶點

通過TCMSP數據庫共篩選得到155個有效化合物，其中柴胡12、黃柏25、白芍8個、蒼術4、枳實18、薏苡仁6、牛膝15、甘草88。對所得化合物進行基因注釋，共得到259種有效靶點。

2 四妙四逆散治療慢性宮頸炎的作用靶點

檢索GeneCards數據庫得到與慢性宮頸炎相關的疾病靶點共5526個，運用Venny軟件與四妙四逆散的259個有效靶點進行取交集后，最終獲得四妙四逆散治療慢性宮頸炎的作用靶點共215個。

3 四妙四逆散治療慢性宮頸炎的中藥-化合物-靶點網絡

在Cytoscape3.8.2軟件中構建四妙四逆散治療慢性宮頸炎的“中藥-化合物-靶點”網絡（圖1），連接度排名在前4位的化合物依次為Quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、kaempferol（山奈酚）、wogonin（黃芩素），即是四妙四逆散治療慢性宮頸炎的核心化合物。

圖1 中藥-活性成分-靶點網絡

4 蛋白質相互作用網絡

在cytoscape3.8.2中導入215個作用靶點，構建拓撲網絡（圖2），得到四妙四逆散治療慢性宮頸炎作用靶點中的樞紐靶點。同時導入String數據庫，構建靶點所編碼的蛋白質之間相互作用的網絡圖（圖3），根據連接度排名將蛋白進行條形排列（圖4），連接度排名在前4位的作用靶點依次為AKT1（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）、IL6（白細胞介素-6）、MAPK3（絲裂原活化蛋白激酶3）、VEGFA（血管內皮生長因子A），這與拓撲網絡得到的樞紐靶點結果一致，因此認為AKT1、IL6、MAPK3及VEGFA即為四妙四逆散治療慢性宮頸炎的核心靶點。

圖2 四妙四逆散治療慢性宮頸炎的拓撲網絡

圖3 作用靶點的蛋白互作網絡圖

圖4 作用靶點的節點數量條形圖

5 四妙四逆散治療慢性宮頸炎的GO及KEGG富集結果

四妙四逆散治療慢性宮頸炎的GO 富集結果共包含2492生物過程（biological process）、135個細胞成分（cellular component）及212個分子功能（Molecular Function）。結果顯示四妙四逆散治療慢性宮頸炎中所調節的生物過程和分子功能主要涉及細胞信號轉導和轉錄、蛋白結合、抗炎、抗氧化、促進免疫應答等方面。KEGG富集共獲得173 條通路，其中得到四妙四逆散與慢性宮頸炎的相關的通路有PI3K-Akt信號通路、IL-17 信號通路、TNF信號通路、Th17細胞分化信號通路、HIF-1信號通路、p53信號通路等。

6 分子對接

分子對接結果顯示槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃芩素等核心化合物與 AKT1、IL-6、MAPK3及VEGFA 等核心靶點具有較好的對接，其中有4對接結果的結合能＜-9.0（圖5），且均來自AKT1與四個核心化合物的對接，因此推測AKT1可能是四妙四逆散治療慢性宮頸炎的重要靶點。

圖5 分子對接結合能結果

討 論

本研究運用網絡藥理學方法和分子對接技術探討四妙四逆散治療慢性宮頸炎的作用機制，結果顯示四妙四逆散治療慢性宮頸炎具有多成分、多靶點的作用特點。其作用核心化合物槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素均屬于黃酮類化合物，大量實驗證實黃酮類化合物具有調控細胞周期、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤生長、提高抗氧化、清除自由基、抗炎抑菌、抑制血管生成、提高機體免疫應答等作用。朱慧敏[6]發現槲皮素能抑制宮頸炎大鼠宮頸組織中炎性因子的表達，減輕炎癥反應。馮艷紅等[7]研究顯示槲皮素能抑制宮頸鱗狀細胞癌細胞增殖，且與槲皮素濃度及作用時間呈正相關。潘磊等[8]發現木犀草素能通過抑制Ras-MAPK信號通路及其下游MMP9、Cyc D1、VEGF等蛋白表達，發揮促進宮頸癌細胞凋亡、抑制細胞增殖遷移的作用。王穎等[9]研究顯示木犀草素能抑制宮頸癌細胞增殖遷移，推測其機制可能與抑制PI3KAKT信號通路活化，抑制其增殖、遷移的相關蛋白表達相關。蔡云朗等[10]發現山奈酚能抑制子宮肌瘤細胞增殖，下調ER、IGF1和VEGF等蛋白及基因表達。漢黃芩素還具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、調節腫瘤細胞侵襲及血管生成等多方面活性作用[11]。

四妙四逆散治療慢性宮頸炎的蛋白拓撲分析及蛋白互作網絡顯示其核心靶點為AKT1、IL6、MAPK3及VEGFA。AKT1是PI3K/AKT通路的中樞靶點，活化的AKT1可調節其多個下游靶標發揮調控細胞的增殖和凋亡、細胞侵襲和轉移、DNA修復、細胞周期及血管生成等作用[12-14]。杜趁香等[15]發現AKT1在慢性宮頸炎及宮頸癌病變組織中呈高表達，劉小葉[16]發現通過下調AKT1蛋白的表達可達到抑制宮頸癌細胞增殖的作用。IL6作為一種細胞因子級聯反應中的核心介質，參與調節機體免疫應答、炎癥反應及腫瘤細胞增殖。邵丹等[17]研究發現宮頸癌患者血清中IL-6水平明顯升高，且與病情進展程度呈正相關。磷酸化激活后的MAPK3參與從細胞骨架變化到基因轉錄的各種細胞反應，具有調控細胞周期和信號轉導、抑制細胞增殖分化、誘導免疫應答及維持細胞穩態等作用[18-19]。曹學全等[20]研究發現在慢性宮頸炎、宮頸炎組織中MAPK3蛋白呈高表達，且其升高水平與疾病進展相關。蔣丹[21]發現MAPK3在宮頸癌組織中呈高表達水平，且與凋亡抑制基因bcl-2在宮頸癌的發生發展中存在協同作用。VEGFA是一種血管內皮生長因子，參與調控血管形態和功能，可誘導腫瘤血管生成，對腫瘤的發生發展起重要作用。朱迎萍等[22]運用自擬宮頸方治療宮頸炎模型大鼠，發現大鼠宮頸組織的炎癥程度與VEGFA、NF-KB等蛋白的表達水平有關。徐美容等[23]研究發現VEGFA在慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌組織中的表達呈逐漸上升趨勢，且其表達水平還與宮頸間質浸潤深度、腫瘤直徑等相關，可作為宮頸癌組織中的生物標志物。

分子對接結果顯示四妙四逆散的核心化合物與其核心靶點有較好的結合作用，其中 AK1與槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃芩素的相互作用更佳，推測AK1可能是四妙四逆散核心化合物干預的主要靶點。其作用靶點富集的GO功能涉及細胞信號轉導和轉錄、蛋白結合、抗炎、抗氧化、促進免疫應答等多個方面。通路富集結果顯示四妙四逆散治療慢性宮頸炎治療可能通過調控PI3K-Akt、p53、TNF、HIF-1、IL-17、Th17 細胞分化等信號通路達到抑制細胞增殖、抑制腫瘤血管生成、提高腫瘤免疫應答等作用。

本研究運用網絡藥理學及分子對接方法發現四妙四逆散治療慢性宮頸炎具有多成分、多靶點、多通路的作用特點，結合核心靶點富集的GO與通路結果，推測四妙四逆散治療慢性宮頸炎可能通過槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素等化合物調節AKT1、IL6、MAPK3及VEGFA等蛋白水平，發揮調控細胞信號周期、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、抗炎、抗氧化、促進免疫應答等作用。