miR-200家族及侵襲相關基因ZEB1、ZEB2和CTNNB1在顱咽管瘤組織中的表達及意義

張道寶，徐建國

顱咽管瘤(craniopharyngioma,CP)是常見的中樞神經系統腫瘤，任何年齡均可發病，但其常見的發病年齡呈雙峰分布，即主要有6～14歲和50～70歲兩個高發年齡段，同時CP是兒童最常見的鞍區占位性病變[1--2]。CP在病理學上可分為兩種亞型，即造釉細胞型顱咽管瘤(adamantinomatous craniopharyngioma，ACP)和鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤(papillary craniopharyngioma，PCP)[3]。CP的侵襲性研究已成為近年來的研究熱點，目前取得了一定進展，但是仍有很多不足。已有研究證實miR-200家族在腫瘤侵襲中起到重要作用，本研究初步探討了miR-200家族在CP組織中的表達情況及其意義。

1 材料和方法

1.1 材料 收集四川大學華西醫院2017年6月—2018年12月經手術切除的ACP、PCP新鮮標本各30例作為研究對象，并且選取同時期在華西醫院神經外科因顱腦外傷而行開顱手術切除的30例失活腦組織作為對照組。本研究已通過醫院倫理委員會審核批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法 HE染色觀察各組組織的病理變化；免疫組化法檢測各組組織中E-cadherin和β-catenin的變化；qRT-PCR測定各組組織中miR-200b-3p、miR-200a-3p、miR-200c-3p、miR-429-3p、miR-141-3p及ZEB1、ZEB2、CTNNB1相對表達水平。

2 結 果

2.1 各組HE染色情況 首先，對照組、PCP組和ACP組均有各自明顯的組織特征:對照組細胞分布均勻，無異常增生；PCP組由單一的多邊形密集排列的鱗狀上皮細胞(黃色箭頭指示)構成；而ACP組具有呈柵欄狀排列的上皮細胞(紅色箭頭指示)，有漩渦狀細胞簇(藍色箭頭指示)等特點。再次是腫瘤與周圍組織交界的特點：PCP組細胞與周圍組織交界線比較平整，沒有見到明顯向周邊組織延伸的跡象；而ACP組呈“指樣”或“島樣”深入周圍腦組織，呈浸潤性生長，侵襲性明顯(如黑色箭頭所示)。見圖1。

圖1 各組HE病理染色結果

2.2 免疫組化法檢測各組E-cadherin和β-catenin變化 根據鏡下染色深淺，與PCP相比，ACP的β-catenin的表達略有升高，且分布在細胞質或者細胞核，而PCP中β-catenin偏向于分布在細胞膜上(圖2A), 與之相反的是，ACP相對于PCP，E-cadherin的表達下降了(圖2B)。

A：β-catenin在ACP主要在細胞質或者細胞核內表達(黑色箭頭)，且表達較正常神經組織(藍色箭頭)及PCP(紅色箭頭)中升高； B：E-cadherin在ACP(黑色箭頭)的表達較在PCP(紅色箭頭)的表達降低

2.3 各組中miR-200家族成員相對表達水平 各組miRNA-200a的相對表達水平比較，ACP組低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。各組miRNA-200b的相對表達水平比較，ACP組低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。各組miRNA-200c的相對表達水平比較，ACP組低于對照組，也低于PCP組，差異有統計學意義(P<0.05)。各組miRNA-429的相對表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。各組miRNA-141的相對表達水平比較，ACP組低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

*/#表示P<0.05，**/##表示P<0.01，***/###表示P<0.001；*：normal vs ACP，#：PCP vs ACP

2.4 qRT-PCR測定各組侵襲相關基因相對表達水平 各組ZEB1、ZEB2、CTNNB1的相對表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，ACP組高于對照組，也高于PCP組。見圖4。

*：與normal相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；#：與PCP相比；#表示P<0.05，##表示P<0.01

3 討 論

多數CP在組織學上為良性腫瘤，惡性CP罕見，但在臨床病程中卻有著與惡性腫瘤相似的特征。術后易復發是CP，特別是ACP的一個重要特點。有文獻報道，CP術后患者經過10年隨訪，其復發率可高達到90%[4]。本研究對3組標本分別進行HE染色發現，正常腦組織細胞分布均勻，無異常增生；PCP組織由單一的多邊形密集排列的鱗狀上皮細胞構成，與周圍組織交界線比較平整，沒有見到明顯向周邊組織延伸的跡象；而ACP組織具有呈柵欄狀排列的上皮細胞，具有漩渦狀細胞簇等特點，呈“指樣”或“島樣”深入周圍腦組織，呈浸潤性生長，侵襲性明顯。

目前在人類基因組中，已發現一千多種miRNA，通過基因調控調著大約30%以上的人類基因[5]。miRNA參與對細胞各種生命活動的調節，包括正常細胞的增殖分化、凋亡，并和腫瘤的發生、發展有密切的關系[6-8]。miRNA-200家族與許多腫瘤的進展和轉移密切相關，miRNA-200家族共有5個成員組成，根據其“種子序列”不同又可分為兩個亞族：miRNA-200c、miRNA-141和miRNA-200a、miRNA-200b及miRNA-429，前者共同序列“AAUACU”；后者為“AACACU”, 兩者之間相差一個核苷酸(C和U)，因它們擁有不同的“種子序列”，所以具有不同的結合特異性，調節的靶基因也有細微的差別，但它們仍有許多共同的靶基因。研究發現，在膀胱癌、子宮內膜癌、前列腺癌等多種腫瘤中，miRNA-200家族的表達明顯低于腫瘤附近的正常組織[9-16]。本研究利用qRT-PCR測定各組miRNA-200家族的表達水平發現，與正常腦組織組相比，ACP組中miRNA-200家族表達整體趨勢是下降的，其中miRNA-200c的下降最為明顯，差異性顯著。而PCP相比于正常腦組織，其miRNA的表達雖然略有下降，但是并不明顯，也沒有特別突出的亞型。與PCP相比，ACP中miRNA-200家族整體也是下降的，同樣是miRNA-200c這個亞型下降最為明顯。本研究結果說明miRNA-200家族在CP，特別是ACP中表達明顯下降，可能起到類似于抑癌基因的作用。

miRNA-200家族主要在上皮細胞中表達，是上皮細胞的標志物[17]，同時在上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的過程中扮演了重要角色。E盒結合鋅指蛋白(zinc finger E-box binding homeobox，ZEB)是重要的細胞核轉錄因子，包括ZEB1/ZEB2，可以直接抑制E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)的表達[18]。miRNA-200家族可直接抑制ZEB1/ZEB2，進而調控EMT[19]。Oba等[20]通過miRNA與ZEB-2的mRNA3′UTR互補序列分析，發現miRNA-200家族對ZEB-2作用顯著，與對照組相比，能抑制ZEB-2 80%的活性。miRNA-200家族過表達后，可結合在ZEB1/ZEB2的3′UTR區使其靶向降解，并使E-cadherin表達上調，從而抑制EMT的發生，降低腫瘤的侵襲性和轉移性。同時，ZEB1/ZEB2也能直接抑制miRNA-200家族的轉錄，兩者之間形成一個負反饋環路，起到相互抑制的作用。本研究利用qRT-PCR技術測定各組ZEB1/ZEB2的表達水平發現，與正常組相比，ACP組中ZEB1/ZEB2表達整體趨勢是上調的，其中ZEB2的上調最為明顯，差異性顯著；而PCP相比于正常組織，ZEB1/ZEB2變化不顯著；與PCP相比，ACP的組織中ZEB1/ZEB2表達整體也是上調的；由此可知，在ACP中ZEB1/ZEB2的表達明顯上調。利用免疫組化技術檢測CP中E-cadherin的表達，結果表明ACP組相對于PCP組，E-cadherin的表達下降了。綜上，在ACP中，存在這樣一個通路，隨著miRNA-200家族表達明顯下調，導致ZEB1/ZEB2表達上調，進而使E-cadherin的表達受到了明顯抑制。

β-連環蛋白(β-catenin)由原癌基因CTNNB1編碼，是一種多功能、高度保守的細胞骨架蛋白。β-catenin可以存在細胞質、細胞膜和細胞核中，研究發現正常神經細胞中的β-catenin主要在細胞膜中表達，而ACP中β-catenin在細胞膜內低表達，在細胞質及細胞核內過表達，并且這些細胞多位于實體瘤邊緣浸潤性較強的位置[21]。本研究利用qRT-PCR技術測定各組CTNNB1的表達水平發現，與正常組相比，ACP組中CTNNB1表達整體趨勢是上調的，差異性顯著；而PCP相比于正常組織，CTNNB1變化不顯著；與PCP相比，ACP的組織中CTNNB1表達整體也是上調的；由此可知，在ACP中CTNNB1的表達明顯上升。通過免疫組化測定，與PCP相比，ACP的β-catenin的表達有升高，且分布在細胞質或者細胞核，而PCP中β-catenin偏向于分布在細胞膜上。綜上，在ACP中，隨著miRNA-200家族表達的明顯下調，其與靶基因CTNNB1的結合減少，導致CTNNB1表達上調，使其編碼蛋白β-catenin的表達升高。

相對于正常腦組織，ACP組中miRNA-200家族表達整體下降，其中miRNA-200c的下降最為明顯，mRNA(ZEB1/ZEB2,CTNNB1)表達整體上調，其中ZEB2的上調最為明顯；PCP相比于正常腦組織，miRNA-200家族的表達略有下降，但是并不明顯，也沒有特別突出的亞型，mRNA(ZEB1/ZEB2,CTNNB1)變化不顯著；與PCP相比，ACP組織中miRNA-200家族整體下降，同樣是miRNA-200c這個亞型下降最為明顯，mRNA(ZEB1/ZEB2,CTNNB1)的表達整體上調。ACP的β-catenin的表達升高，且分布在細胞質或者細胞核，而PCP中β-catenin偏向于分布在細胞膜上。ACP相對于PCP，E-cadherin的表達下降。綜上所述，miRNA-200家族在CP中可能起到類似于抑癌基因的作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。