白術多糖對類風濕性關節炎大鼠的抗炎作用及TLR4/NF-κB信號通路的影響

李 梅，蔣錦梅，歐大明，黃麗芳，謝立虎,張 濟

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節滑膜組織炎癥為特征的自身免疫性慢性疾病，可導致多關節炎癥、滑膜增生、關節破壞畸形等。臨床表現為關節疼痛、酸脹、晨僵、活動受限，因其較高的致畸和致殘率，給患者造成了極大的痛苦[1]。白術多糖(polysaccharide of atractylodes macrocephala koidz，PAMK)是天然中草藥白術的主要有效成分之一，具有抗腫瘤、免疫調節、抗炎等多重藥理作用[2]。有研究[3]顯示，Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)及其介導的核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路，通過誘發機體炎癥反應、介導炎癥因子表達，成為RA發病的關鍵。而PAMK可通過調控TLR4/NF-κB信號通路調節機體免疫功能[4]。推測PAMK可能會通過抑制TLR4/NF-κB信號通路改善RA，但PAMK在RA過程中具體作用如何，目前尚未見報道。因此，該研究擬建立RA大鼠模型，探討PAMK對RA的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD雄性大鼠60只，8周齡，體質量300～350 g，購自重慶醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證：SCXK(渝)2018-0003。于室溫22～24 ℃，相對濕度50%～70%環境下飼養，實驗期間嚴格按照實驗動物倫理學要求，自由飲水和攝食，實驗前適應性喂養1周。

1.2 主要試劑及儀器PAMK購自陜西慈緣生物技術有限公司；雷公藤多苷片購自浙江得恩德醫藥有限公司；牛Ⅱ型膠原購自美國Chondrex公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司；TLR4、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor，MyD88)、p-NF-κB p65(Ser536)、NF-κB p65、Histone H3及β-actin抗體購自英國Abcam公司；Nuclear Extract Kit試劑盒購自美國Active Motif公司；HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；大鼠白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；全自動酶標儀購自美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1動物模型制備與分組 參考文獻[5]，采用Ⅱ型膠原誘導建立RA大鼠模型。具體操作如下：以醋酸為溶劑，將牛Ⅱ型膠原配制成濃度為2 mg/ml的溶液，與弗氏完全佐劑按1 ∶1混合配成乳劑Ⅰ，與弗氏不完全佐劑按1 ∶1混合配成乳劑Ⅱ。第1天于大鼠尾根部皮下注射乳劑Ⅰ，每只0.1 ml，第7天于大鼠尾根部皮下注射乳劑Ⅱ，每只0.1 ml。造模2周后，大鼠后肢足趾紅腫，踝關節體積明顯增大，提示造模成功。將造模成功大鼠隨機分為模型組、陽性藥物組和PAMK低、高劑量組，同時設置正常對照組，每組12只。分組后陽性藥物組大鼠給予6.25 mg/kg[6]雷公藤多苷片灌胃，PAMK低、高劑量組大鼠分別按75、300 mg/kg劑量灌胃給予PAMK，正常對照組及模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，1次/d，連續4周。

1.3.2體質量檢測 從第2次免疫(給藥干預第0天)開始，每隔7 d測量1次各組大鼠體質量。

1.3.3足趾腫脹度檢測 采用水容積法，從第2次免疫(給藥干預第0天)開始，每隔7 d測量1次各組大鼠右后足容積。

1.3.4關節炎指數檢測 參考文獻[6]，從第2次免疫(給藥干預第0天)開始，采取5級評分法，每隔7 d觀察計算1次各組大鼠關節炎指數。大鼠所有關節炎指數之和即為每只大鼠關節炎指數值，最高計16分。

1.3.5胸腺和脾臟指數檢測 取脾臟和胸腺組織，剔除脂肪，濾紙吸干表面液體并精密稱量，分別計算其占體質量的比例(mg /g)。

1.3.6HE染色 取踝關節滑膜組織，于4%多聚甲醛中固定24 h，隨后經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、液體石蠟浸蠟、石蠟包埋等過程后，作連續5 μm切片，行常規HE染色，于光學顯微鏡下觀察。

1.3.7ELISA檢測 取踝關節滑膜組織勻漿及腹主動脈全血，于4 ℃下4 000 r/min離心10 min，分別提取上清液及血清，按照試劑盒操作說明，檢測各組大鼠血清及踝關節滑膜組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.3.8Western blot檢測 取踝關節滑膜組織，用RIPA裂解液提取總蛋白、Nuclear Extract Kit試劑盒提取核蛋白，通過BCA法進行蛋白質定量，取20 μg總蛋白或核蛋白與上樣緩沖液均勻混合，隨后SDS-PAGE電泳并進行轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入TLR4抗體(兔抗，1 ∶1 000)、MyD88抗體(兔抗，1 ∶1 000)、p-NF-κB p65抗體(兔抗，1 ∶1 000)、NF-κB p65抗體(兔抗，1 ∶1 000)、Histone H3抗體(兔抗，1 ∶1 000)、β-actin抗體(兔抗，1 ∶1 000)一抗，搖床孵育過夜；然后加入二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h后ECL顯色，以Histone H3、β-actin表達水平作為內參，應用Image J進行灰度分析，分析總蛋白TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及核蛋白NF-κB p65的相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量比較與正常對照組比較，模型組大鼠體質量降低(P<0.05)；與模型組比較，治療1周后陽性藥物組、PAMK高劑量組大鼠體質量升高(P<0.05)，而PAMK低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質量比較

2.2 各組大鼠足趾腫脹度比較與正常對照組比較，模型組大鼠足趾腫脹度升高(P<0.05)；與模型組比較，治療1周后陽性藥物組、PAMK高劑量組大鼠足趾腫脹度降低(P<0.05)，而PAMK低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠足趾腫脹度比較

2.3 各組大鼠關節炎指數比較與正常對照組比較，模型組大鼠關節炎指數升高(P<0.05)；與模型組比較，治療1周后陽性藥物組、PAMK高劑量組大鼠關節炎指數降低(P<0.05)，而PAMK低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠關節炎指數比較分，n=12)

2.4 各組大鼠胸腺、脾臟指數比較與正常對照組比較，模型組大鼠胸腺、脾臟指數升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥物組、PAMK高劑量組大鼠胸腺、脾臟指數降低(P<0.05)，而PAMK低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠胸腺、脾臟指數比較

2.5 各組大鼠踝關節滑膜組織病理學變化如圖1所示，正常對照組大鼠滑膜組織結構正常，表面光滑無增生；模型組、PAMK低劑量組大鼠滑膜組織增生，層次不清，伴有大量炎性細胞浸潤；陽性藥物組、PAMK高劑量組滑膜組織增生和炎性細胞浸潤明顯改善。

圖1 踝關節滑膜組織HE染色 ×400A:正常對照組；B：模型組；C：陽性藥物組；D：PAMK低劑量組；E：PAMK高劑量組

2.6 各組大鼠血清及踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平與正常對照組比較，模型組大鼠血清及踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥物組、PAMK高劑量組大鼠血清及踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05)，而PAMK低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組血清及踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平

2.7 各組大鼠踝關節滑膜組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表達水平與正常對照組比較，模型組大鼠踝關節滑膜組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表達水平升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥物組、PAMK高劑量組大鼠踝關節滑膜組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表達水平降低(P<0.05)，而PAMK低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表6。

圖2 Western blot檢測各組心肌組織中TLR-4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表達A：正常對照組；B：模型組；C：陽性藥物組；D：PAMK低劑量組；E：PAMK高劑量組

表6 各組踝關節滑膜組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白相對表達水平

3 討論

自身免疫激活是RA發病的關鍵，隨后的炎癥因子大量釋放，導致滑膜炎癥發生。蒼術屬植物種類繁多，白術是其中之一，在中國藥典中白術和蒼術有著明確的區分，但在日本部分品種的蒼術也被當做白術使用。有學者研究了包括白術在內的五種蒼術屬植物在RA中的作用，發現這些植物均可有效降低RA大鼠血清中炎癥因子水平，從而改善RA[7]。但其研究僅限于白術復合物，并非單體物質，復合物的藥理成分復雜，穩定性差，而PAMK作為白術中起主要作用的單體物質，成分單一，穩定性更好。因此，本研究進一步探索了PAMK對RA的抗炎作用及可能機制。

本研究通過Ⅱ型膠原誘導建立RA大鼠模型后，模型組大鼠精神倦怠，食欲減退，四肢出現明顯紅腫及變形，體質量較正常對照組大鼠顯著降低，足趾腫脹度和關節炎指數顯著升高，且踝關節滑膜組織增生，病理學改變明顯，以上提示RA大鼠造模成功。經PAMK治療后，大鼠體質量較模型組顯著升高，足趾腫脹度和關節炎指數顯著降低，且踝關節滑膜組織結構趨于正常，說明PAMK可保護RA大鼠踝關節滑膜組織，對RA有改善作用。

脾臟和胸腺是機體內重要的免疫器官，胸腺指數和脾臟指數可以在一定程度上反映機體免疫水平的高低及狀態。本研究結果顯示，模型組大鼠胸腺指數和脾臟指數較正常對照組顯著升高，標志著RA大鼠免疫系統的激活，局部抗原發生改變，在滑膜組織中炎癥因子大量釋放，導致滑膜炎癥的發生[8]。IL-1β是一種破骨細胞激活因子，它常與TNF-α同時合成和分泌，共同破壞關節軟骨，造成關節損傷[9]。IL-6是一種重要的促炎因子，參與多種人體炎癥反應和疾病，同時還能促進免疫細胞的增殖和分化[10]。IL-1β、IL-6和TNF-α刺激著軟骨細胞、滑膜細胞分泌膠原酶等物質，破壞軟骨細胞周圍環境，是RA過程中起主要作用的炎性介質[11]。本研究顯示，模型組大鼠血清及踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平較正常對照組顯著升高，經PAMK治療后，大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低，且胸腺指數和脾臟指數顯著降低，說明PAMK可通過調節機體免疫水平，從而減輕RA大鼠炎癥反應。

MyD88是TLR4/NF-κB信號通路中重要的接頭蛋白分子，可以通過傳導信號激活下游多種轉錄因子。TLR是非特異性免疫反應中的重要的蛋白質分子，能夠通過識別脂多糖、膜脂蛋白等分子參與機體免疫系統調節[12]。其中TLR4是關鍵信號傳導蛋白之一，可以通過與相應配體結合活化NF-κB，啟動和調控炎癥聯級反應，在RA過程中發揮重要作用[13]。NF-κB由p65和p50兩個亞基組成，通常情況下與其抑制性蛋白IκB結合而呈非活化狀態，受到刺激后，NF-κB p65磷酸化使IκB降解，導致NF-κB入核并活化，從而刺激炎癥因子的釋放，加重炎癥損傷[14]。本研究顯示，模型組大鼠踝關節滑膜組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表達水平較正常對照組顯著升高，標志著TLR4/NF-κB信號通路的激活，經PAMK治療后，大鼠TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低，說明PAMK減輕RA大鼠機體炎癥反應，可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路實現的。

綜上所述，PAMK可以通過減輕機體炎癥反應，起到對RA大鼠的治療和保護作用，其機制可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的活化實現的，為RA的臨床治療提供了新的參考依據。