耐碳青霉烯大腸埃希菌分子特征和同源性分析

黃家祥，王中新，潘亞萍，徐元宏

大腸埃希菌是引起醫院和社區感染的主要病原體之一，通常作為人類和動物腸道正常菌群存在，但是在某些情況下，可引起人類腸道感染，還可侵入腸外組織引起尿路感染、腹腔感染、膽道感染、肺部感染、血流感染、腦部感染和肌肉結締組織感染等[1]。近年來隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯大腸埃希菌(carbapenem-resistantEscherichiaColi，CREC)已屢見不鮮。為了更好了解CREC耐藥情況，預防耐藥菌株院內傳播，該研究收集安徽醫科大學第一附屬醫院近5年的大腸埃希菌，從中篩選出碳青酶烯耐藥的菌株，探討CREC產碳青霉烯酶的表型、產酶基因的構成及其分子流行病學。

1 材料與方法

1.1 菌株來源收集安徽醫科大學第一附屬醫院2015年1月-2019年12月臨床標本分離并-20 ℃保存的6 092株大腸埃希菌，選取對厄他培南、亞胺培南或美羅培南耐藥的菌株，轉種血瓊脂培養基復蘇細菌，剔除重復分離株和死亡株，共71株CREC納入本次研究。質控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706。

1.2 儀器與試劑Vitek-2 Compact微生物鑒定儀、MALDI-TOF-MS質普儀、血瓊脂培養基、MH瓊脂培養基(法國Bio Merieux公司)，PCR擴增儀、凝膠成像系統、電泳儀(美國BIO-RAD公司)，高速離心機(德國Eppendorf公司)，生物安全柜(蘇凈安泰空氣技術有限公司)，亞胺培南西司他丁鈉[默沙東(中國)有限公司]，瓊脂糖(德國Biofroxx公司)，硫酸鋅、酚紅(中國醫藥集團有限公司)，Taq PCR Mix 預混液(2×，含紅染料)、引物、4S Red Plus核酸染料、TBE粉末、DNA分子量標準Marker(上海生工生物工程有限公司)。

1.3 細菌鑒定與藥敏采用Vitek-2 Compact進行細菌鑒定，MALDI-TOF-MS質普儀進行確認。細菌藥敏實驗采用Vitek-2 Compact配套藥敏卡AST-N334，紙片法進行復核和補充。

1.4 耐碳青酶烯酶表型實驗

1.4.1改良Hodge實驗 用無菌生理鹽水制備0.5麥氏濃度的大腸埃希菌ATCC 25922菌懸液，將菌懸液用生理鹽水按1 ∶10稀釋后，無菌棉簽蘸取稀釋后的菌液，均勻涂布于MH瓊脂平板上，自然干燥5～10 min，平板中央貼美羅培南(10 μg)紙片，用一次性無菌1 μl接種環挑取適量過夜培養的待測菌落，沿美羅培南紙片邊緣，垂直方向畫待測菌線，菌線長20～25 mm，空氣環境中35 ℃培養18～24 h，結果判讀：待測菌線與抑菌圈交界處大腸埃希菌ATCC 25922呈增強生長，判為陽性結果；無增強生長，則為陰性結果。

1.4.2mCIM實驗 用10 μl接種環刮取1環血瓊脂平板過夜培養的待測細菌加入含400 μl無菌水的EP管中，震蕩混勻，浸入美羅培南紙片(10 μg)，35 ℃溫育2 h。取出紙片，擠出多余菌液，貼于均勻涂布有0.5麥氏濃度大腸埃希菌ATCC 25922菌液的MH瓊脂上，35 ℃溫育18～24 h，測量抑菌圈直徑。結果判讀：① 抑菌圈直徑為6～15 mm或直徑為16～18 mm但抑菌圈內有散在菌落生長，提示待測菌株產碳青霉烯酶。② 抑菌圈直徑≥19 mm，提示待測菌株不產碳青霉烯酶。③ 抑菌圈直徑為16～18 mm或直徑為≥19 mm但抑菌圈內有散在菌落生長，提示無法判斷是否存在碳青霉烯酶。

1.4.3Carba NP實驗 取a、b兩個無菌EP管，均加入100 μl細菌蛋白提取液，用1 μl接種環取兩環血平板上培養過夜的待測菌單菌落分別加入a、b管中，渦旋震蕩5～10 s，再向a管中加入A液100 μl，向b管中加入B液100 μl，35 ℃孵育2 h，每0.5 h觀察記錄管中顏色變化。結果判讀：① a、b管均為紅色或橙紅色，提示未檢出碳青霉烯酶。② a管紅色或橙紅色，b管淺橙色、黃色或深黃色，提示檢出碳青霉烯酶。③ a管紅色或橙紅色，b管橙色，提示試驗結果無效。④ a管橙色、黃色或深黃色，b管任何顏色，提示試驗結果無效。

1.5 PCR擴增耐藥基因參照文獻設計碳青霉烯酶基因引物，并由上海生工公司合成，引物序列見表1。采用煮沸法制備擴增模板。PCR反應體系總體積為50 μl：Taq PCR Master Mix(2×，red dye)25 μl，10 μmol/L正反引物各2 μl、DNA模板1 μl、ddH2O 20 μl。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s、根據各引物退火溫度退火30 s、72 ℃延伸1 min、72 ℃最后延伸10 min、39個循環。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統觀察結果。陽性擴增產物委托上海生工公司進行測序，使用NCBI網站的Blast程序對基因序列進行比對，以確定基因型及其亞型。

表1 PCR引物序列

1.6 ERIC-PCRERIC-1引物序列為： 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC-2引物序列為：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，由上海生工公司合成，反應條件如下：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min、72 ℃最后延伸10 min、30個循環。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統觀察紀錄結果。結果判斷：將電泳圖譜條帶位置相同的菌株視為同一型別。

1.7 統計學處理藥敏試驗結果參照CLSI 2018標準進行判讀，使用WHONET 5.4軟件對細菌數據進行統計分析。

2 結果

2.1 菌株基本資料5年間CREC的檢出率分別為1.00%(12/1198)、1.12%(14/1247)、1.01%(13/1287)、1.22%(15/1230)、1.50%(17/1130)，71株CREC主要來自尿液29株，其次為痰液15株，分泌物10株，血液5株；穿刺液、創面、腹水、引流液各2株；膽汁、腦脊液、膿液和咽拭子均為1株。病區來源以ICU和燒傷科為主，分別為8株和7株，其次為泌尿外科、門診各5株；肝膽外科、感染科、急診內科和康復科各4株；干部病房、神經外科、血液科和腫瘤科各3株；風濕科、呼吸科、神經內科、腎內科、胃腸外科、消化科和心臟外科各2株；產科、新生兒科、內分泌科和皮膚科各1株。

2.2 藥物敏感性結果71株CREC對常見抗菌藥物的耐藥率普遍居高，見表2。

表2 71株CREC對常見抗菌藥物的耐藥率

2.3 表型試驗結果71株CREC中45株MHT陽性， 67株mCIM陽性，69株Carba NP陽性，陽性率分別為63.38%、94.37%、97.18%。部分陽性結果見圖1～3。

圖1 部分菌株MHT試驗結果陽性對照：1705即肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705；陰性對照：1706即肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706；21：編號21的CREC(MHT陽性)

圖2 部分菌株mCIM試驗結果陽性對照：ATCC 1705即肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705；陰性對照：ATCC 1706即肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706；9、12：編號9、12的大腸埃希菌(mCIM陽性)

圖3 部分菌株Carba NP試驗結果陽性對照：肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705；陰性對照：肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706；1～5：Carba NP試驗陽性菌株；47：Carba NP試驗陰性菌株

2.4 耐藥基因PCR擴增結果71株CREC共有43株檢出碳青酶烯酶基因，檢出率為60.56%，34株攜帶blaNDM中有7株為blaNDM-1，27株為blaNDM-5，9株攜帶blaKPC均為blaKPC-2。其余碳青酶烯酶基因blaBIC、blaIMP、blaSPM、blaAIM、blaGIM、blaDIM、blaSIM、blaGES、blaOXA-48均未檢出。部分碳青酶烯酶基因電泳圖譜見圖4。

圖4 部分blaNDM陽性電泳圖譜M：DL2000 DNA Marker；1：陰性對照；2：陽性對照；3～11：blaNDM陽性菌株；12：blaNDM陰性菌株

2.5 ERIC-PCR結果71株CREC的ERIC-PCR電泳圖譜產生2～8條不同的條帶模式，范圍從100～2 000 bp，共分為19個型別，其中A型9株，B型8株，C型7株，D型6株，E型6株，F型5株，G型5株，H型4株，I型4株，J型4株，K型3株，L型2株，M型2株，N型、O型、P型、Q型、R型、S型各1株。部分菌株ERIC-PCR電泳圖譜見圖5。

圖5 部分菌株ERIC-PCR電泳圖譜M：DNA Marker；2、3、6、8、11、14：B型；1、4、9、10、13、15：C型；18：A型；16：D型；19：E型；17：G型；7：K型；5：M型；12：P型

3 討論

近年來，隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯腸桿菌科細菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae, CRE)在世界范圍內越來越普遍。中國細菌耐藥性監測網CHINET監測結果[6]顯示大腸埃希菌對亞胺培南的耐藥率由2014年的0.9%上升到2019年的2.0%。另外CRE感染往往會引起較高的死亡率，Tamma et al[7]研究發現32%的CRE血液感染患者在14 d內死亡，因此，防控CRE的產生和傳播意義重大。

5年間，本院CREC的檢出率基本維持在低位水平，平均為1.17%，且分離至不同年份不同科室，ICU和燒傷科來源的菌株數量略高于其他科室，可能與這兩個科室的患者病情常較重，大量抗生素的使用和進行過侵襲性操作有關。本研究中，尿液標本分離的CREC高于其他樣本類型，與Tian et al[8]研究結果一致，這對臨床醫師治療泌尿道感染提出了嚴峻的挑戰，由于氨基糖苷類、喹諾酮類和碳青霉烯類藥物通常用于治療泌尿系統感染，而CREC對這幾類藥物往往表現出較高的耐藥性。

到目前為止，CLSI先后推薦了MHT、Carba NP和mCIM作為碳青霉烯酶的表型篩選實驗。MHT操作簡單且成本低廉，對流行廣泛的KPC具有很好的檢測能力，但對新德里金屬-β-內酰胺酶(NDM)、粘質沙雷菌型碳青霉烯酶(SME)和苯唑西林酶(OXA)的敏感性較低[9]。Carba NP通過測量細菌提取物對亞胺培南的體外水解情況來檢測碳青霉烯酶，Carba NP對大多數碳青霉烯酶具有較好的敏感性，然而，在檢測相對較弱的OXA型碳青霉烯酶時存在一定的局限[10]。mCIM是2017年CLSI推薦的一種用于篩選碳青霉烯酶表型的新型試驗，有研究[11]表明mCIM篩選腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶具有較高的特異性和敏感性。本研究中，34株產NDM的菌株只有22株MHT陽性，說明MHT對NDM型碳青霉烯酶的檢測能力有限。71株CREC，mCIM陽性67株，陽性率94.4%，略低于閆玲 等[12]報道的陽性率100%。Carba NP陽性69株，僅有2株陰性，雖然Carba NP具有很好的檢測效能，但是所需試劑準備繁瑣、保質期較短，大規模流行病學篩查遠比實驗室小樣本檢測更能體現其優勢。

產NDM細菌發現之初被稱為“超級細菌”，可見其耐藥情況嚴重，NDM能夠水解幾乎所有的β-內酰胺類抗生素，大腸埃細菌和肺炎克雷伯菌是blaNDM的主要攜帶者。目前世界范圍內均發現NDM陽性菌株，尤以印度次大陸、中東和巴爾干地區的流行率最高[13]。一項關于CRE在國內流行情況的研究[14]顯示，25個省、直轄市中，除北京、上海和四川外，NDM是CREC最常見的碳青霉烯酶。本研究中，43株CREC檢出耐碳青霉烯基因，34株(34/43，79%)攜帶blaNDM，9株(9/34，21%)攜帶blaKPC-2，提示blaNDM是本院CREC主要攜帶的碳青霉烯酶基因，與全國絕大多數地區相一致。

ERIC-PCR是一種可靠、快速的基因分型方法，目前已廣泛應用于細菌的流行病學研究。本研究使用該技術對71株CREC之間的遺傳相關性進行研究，CREC被分為A-S共19個型別，沒有發現優勢型別，相同型別菌株所屬科室較為分散，且分離年份未見集中現象。說明本院流行的CREC基因多態性較高，以散發為主。