基于高效液相色譜一測多評法聯合化學計量學的決明降脂片綜合質量評價

陳薇娜，馮 霞，陳丹丹，袁 強，李全清（.杭州師范大學附屬蕭山醫院/浙江蕭山醫院藥學部，浙江 杭州 0；.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 005；.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 005）

決明降脂片由茵陳、何首烏、決明子和桑寄生等加工而成，現代研究表明其具有顯著的保肝、利膽、降血脂、降血壓、抗動脈粥樣硬化作用[1]。其質量標準[2]未對制劑所含任何成分進行定量分析，以往研究[3-4]僅對該制劑所含1 ～ 2種成分進行了定量分析，難以保證產品質量的均一性及有效性。多指標[5-6]的定量分析有利于較好地體現其整體性和系統性，本實驗以2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為內參物，運用高效液相色譜一測多評法對決明降脂片中濱蒿內酯、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、決明子苷B2、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素進行同步檢測，建立決明降脂片多指標質量評價模式，同時對3個廠家15批次決明降脂片進行化學計量學分析，以期為全面評價其內在質量提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（UltiMate 3000型，美國Thermo Fisher Scientific公司；Waters 2695型，美國Waters公司）；SB3200DT型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；XP205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Symmetry Shield C18柱、Welc Xtimate C18柱和Unitary C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）。

對照品濱蒿內酯、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和橙黃決明素（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111511-201704、111894-202104、110844-202116和111900-202006，含量依次為99.9%、95.1%、94.8%和99.0%）；3,5-O-二咖啡酰奎寧酸和美決明子素（成都普瑞法科技開發有限公司，批號分別為PRF10031122和PRF8101721，含量依次為98.7%和99.6%）；決明子苷B2、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷和決明子苷C（武漢天植生物技術有限公司，含量均為98.0%）；決明降脂片（山西華元醫藥生物技術有限公司，批號200102、200103、201101、201103、210302、210802和210803，編號S1 ～ S7；吉林吉春制藥股份有限公司，批號200102、210104、210304和200501，編號S8 ～ S11；長春人民藥業集團有限公司，批號20201101、20210201、20210301和20210501，編號S12 ～ S15）；乙腈和甲酸為色譜級別，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對照品溶液 精密稱取對照品濱蒿內酯、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、決明子苷B2、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素適量，用80%甲醇制成0.596、0.318、0.232、0.836、0.510、1.192、0.428、0.254和0.196 mg·mL-1的混合對照品貯備液。取上述貯備液用80%甲醇稀釋20倍制得混合對照品溶液（9種成分質量濃度分別為29.8、15.9、11.6、41.8、25.5、59.6、21.4、12.7、9.8 μg·mL-1）。

2.1.2 供試品溶液 取決明降脂片，除去糖衣，研細，取細粉約0.5 g，精密稱定，置于25 mL量瓶，加80%甲醇20 mL，超聲處理60 min，放冷，80%甲醇定容，搖勻濾過，續濾液為決明降脂片樣品溶液。取按決明降脂片質量標準制備的缺茵陳、缺何首烏、缺決明子的陰性樣品，按上述方法制得相應的陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

Symmetry Shield C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃；檢測波長為320 nm（0 ～ 25 min測定濱蒿內酯、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸和2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）[7-11]和284 nm（25 ～ 65 min測定決明子苷B2、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素）[12-14]；流動相為乙腈-0.1%甲酸，進行線性梯度洗脫（0 ～ 10 min，13.0%乙腈；10 ～ 19 min，13.0% → 26.0%乙腈；19 ～ 25 min，26.0% → 50.0%乙腈；25 ～ 55 min，50.0% → 61.0%乙腈；55 ～ 65 min，61.0% → 13.0%乙腈），流速1.0 mL·min-1，進樣量10 μL。理論塔板數按內參物峰計≥5500。

2.3 專屬性考察

取“2.1”項下混合對照品溶液及供試品溶液在“2.2”項下色譜條件下進樣檢測，記錄色譜圖（圖1）。結果顯示決明降脂片樣品溶液中9種成分與相鄰色譜峰的分離度均≥1.5；陰性樣品不干擾各成分檢測。

圖1 HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系 精密吸取“2.1”項下混合對照品貯備液，用80%甲醇分別稀釋一定倍數制得6個混合對照品溶液，依法進樣，以9種成分質量濃度和峰面積進行線性回歸，計算得出9種成分的回歸方程和線性范圍，見表1。

表1 決明降脂片中9種成分的線性關系考察結果Tab 1 Linearity results of nine components in Jueming Jiangzhi tablets

2.4.2 精密度、重復性和穩定性 取決明降脂片（S1）溶液在“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，得9種成分峰面積的RSD依次為1.01%、1.34%、1.39%、0.77%、0.84%、0.58%、0.91%、1.26%、1.53%，表明儀器精密度良好。取決明降脂片（S1）適量，制備供試品溶液6份，在色譜條件下進樣檢測分析，并計算含量，得9種成分含量的RSD依次為1.47%、1.62%、1.70%、1.34%、1.46%、0.98%、1.56%、1.75%、1.92%，表明方法重復性良好。取上述進行重復性試驗的任一份決明降脂片溶液，在色譜條件下于制備后0、2、4、8、15、24 h進樣分析，得9種成分峰面積的RSD依次為0.98%、1.36%、1.44%、0.80%、0.79%、0.56%、0.93%、1.31%、1.49%，表明決明降脂片供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.3 加樣回收率 取已知待測成分含量并去除糖衣的決明降脂片（S1），研細，取細粉9份，每份0.25 g，精密稱定后均分成3組，精密加入混合對照品溶液（9種成分質量濃度分別為0.461、0.239、0.155、0.659、0.397、0.914、0.332、0.199、0.103 mg·mL-1）0.8、1.0、1.2 mL，再依法制成加樣樣品溶液。依法檢測，9種成分的平均加樣回收率及RSD分別為99.55%（1.12%）、98.28%（1.35%）、97.82%（1.56%）、100.10%（0.79%）、98.67%（0.90%）、100.06%（0.58%）、97.33%（1.08%）、96.96%（1.32%）、97.86%（1.15%）。

2.4.4 相對校正因子（?）的計算 依法進樣“2.4.1”項下6個混合對照品溶液，用對照品質量濃度與峰面積之比計算各成分?，即?k/s= ?k/?s=（Wk/Ak）/（Ws/As）=（WkAs）/（WsAk）（其中W和A分別代表質量濃度和峰面積，k和s分別代表內參物和其他待測成分）。以2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為內參物，分別計算其它8種成分與之的平均?及RSD分別為0.781 2（0.56%）、1.247 9（1.89%）、2.124 2（1.60%）、0.841 6（1.46%）、0.721 3（0.96%）、0.898 1（0.78%）、1.685 9（1.37%）、2.883 7（0.44%）。

2.4.5 ?耐用性考察 取“2.1”項下混合對照品溶液進樣檢測，分別考察儀器（UltiMate 3000型和Waters 2695型高效液相色譜儀）和色譜柱（Symmetry Shield C18、Welc Xtimate C18和Unitary C18）、流速（1.0±0.2）mL·min-1、柱溫（30±5）℃對?的影響，結果顯示不同儀器與色譜柱下平均?及RSD分別為0.785 8（0.64%）、1.242 9（1.91%）、2.120 8（1.84%）、0.842 2（1.56%）、0.721 9（1.34%）、0.893 0（1.49%）、1.682 1（1.40%）、2.879 4（0.59%）；不同流速時平均?及RSD分別為0.775 4（1.18%）、1.242 6（1.90%）、2.122 7（1.74%）、0.845 3（1.58%）、0.715 9（1.25%）、0.895 6（0.82%）、1.686 6（1.66%）、2.881 0（0.68%）；不同柱溫下平均?及RSD分別為0.783 6（0.69%）、1.241 6（1.93%）、2.129 5（1.45%）、0.847 6（1.40%）、0.726 2（1.10%）、0.903 0（1.06%）、1.685 8（1.48%）、2.885 7（0.63%）。

2.5 含量測定

取15批決明降脂片（S1 ～ S15），依法制備決明降脂片供試品溶液，再依法進樣分析，分別運用外標法（external standard method，ESM）和一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single marker method，QAMS）計算決明降脂片中各成分的含量，并比較兩種方法檢測結果的差異（表2）。結果顯示兩種方法無顯著性差異（P＞ 0.05）。

表2 含量測定結果. mg·g-1，n = 3Tab 2 Results of content determination. mg·g-1, n = 3

2.6 化學計量學質量分析

將表2中QAMS法數據導入SPSS 26.0統計軟件中進行聚類分析和主成分分析。聚類分析結果顯示15批決明降脂片聚為3類，同一廠家的產品聚為一類。主成分分析結果顯示前3個主成分代表決明降脂片85.55%的質量信息。表明同一生產企業所生產的決明降脂片產品質量相對穩定，不同生產企業間決明降脂片產品質量有差異，中藥復方制劑產品質量受原藥材種屬、產地、原藥材內控標準以及各生產企業制劑生產所用設備、質控參數等影響。

3 討論

3.1 指標成分及內參物的選擇

決明降脂片由茵陳、何首烏、決明子和桑寄生等加工而成，方中茵陳清利濕熱、利膽退黃，決明子清熱明目、潤腸通便，合為君藥；何首烏解毒消癰、潤腸通便，桑寄生補肝腎、強筋骨為臣藥。本試驗以茵陳、決明子、何首烏為研究對象，選擇9種成分為指標，采用HPLC-QAMS法進行定量分析。選取質穩價廉、出峰時間適中且含量較高的2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為內參物。

3.2 提取方式的選擇

本試驗在選擇供試品提取方式時，首先以甲醇[9-11]和乙醇[13]為溶劑，超聲提取后檢測，結果以甲醇為溶劑時，9種成分的提取率較高，進而考察了超聲[7-9]和加熱回流[14]，提取時間：50、60和70 min，同時摸索了甲醇溶液的濃度（50%[7]、80%[11]和100%[8-10]），結果顯示80%甲醇為溶劑時，超聲提取效果最好，提取60、70 min時，提取效果無顯著差異，綜合上述條件，選取80%甲醇超聲提取60 min為供試品提取方式。

綜上，本試驗采用HPLC-QAMS法對決明降脂片中9種成分含量進行同時測定，建立了決明降脂片多指標成分質控模式，同時對3個廠家15批決明降脂片運用化學計量學進行分析，發掘復雜數據中潛在的規律。所建立的方法簡單易行，準確可靠，為決明降脂片質量標準的提高提供了參考依據。