丙酮酸乙酯通過調控小膠質細胞極化減輕腦缺血再灌注損傷實驗研究

張霞婧，毛肖肖，朱芳蕓，小 輝，邵勇平，鄭 凌

(1.西安市人民醫院 西安市第四醫院麻醉科，陜西 西安710004；2.開封市第三人民醫院神經內科，河南 開封475100)

腦缺血再灌注損傷嚴重威脅患者的生命安全，是一個涉及鈣超載、炎性反應、細胞凋亡、自由基損傷等一系列復雜的級聯反應[1-2]，特征是先出現短暫的腦缺血，然后再灌注。研究[3-5]表明，在中樞神經系統中，小膠質細胞通過吞噬垂死的神經元和激活程序性細胞死亡來調節神經發生，是中樞神經系統的常駐免疫細胞，負責維護腦內穩態，在大腦發育、突觸重塑和認知改善過程中起著重要的作用。小膠質細胞介導的中樞炎性反應是腦缺血再灌注損傷的主要病理生理改變之一[6]。在各種炎性刺激作用下，穩態的小膠質細胞被活化，促進中樞神經系統炎癥病理過程的發展?；罨∧z質細胞具有兩種極化表型，稱為促炎表型(M1型)和抑炎表型(M2型)，M1型可釋放炎癥介質和自由基，損傷神經元，破壞突觸結構；而M2型可吞噬清除壞死細胞，釋放腦源性神經營養因子[7]等神經營養因子，促進腦組織修復。因此，對小膠質細胞M1/M2極化表型的調控被認為是治療腦缺血再灌注損傷的重要靶點之一[8]。丙酮酸是生物體代謝中的重要物質，具有抗氧化、抗炎、改善細胞代謝等多種功能，并能提高細胞對缺氧的耐受能力[9-10]。丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate,EP)是丙酮酸的酯化物，可溶于水且性質穩定，進入生物體后轉化為丙酮酸發揮作用。有研究[11-12]表明，腹腔注射EP溶液可顯著減小大鼠腦缺血再灌注丘腦梗死容積[13]，改善神經功能缺損評分，并降低損傷側皮層炎癥因子白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的蛋白表達，提示EP可能通過抗炎作用減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。但其對小膠質細胞極化的影響尚不清楚。本研究擬評價EP對腦缺血再灌注損傷大鼠小膠質細胞極化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級成年雄性SD大鼠72只，體重220～250 g，購自空軍軍醫大學實驗動物中心，飼養室溫度22～25 ℃，給予12 h明暗循環，動物自由進食和飲水，在造模前適應性飼養6 d。本研究經過西安市第四醫院倫理委員會審批(20180018)。線栓購自北京西濃科技有限公司，EP購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：采用隨機數字表法將大鼠分為三組(n=24)：假手術組(Sham組)、大腦中動脈栓塞組(MCAO組)和EP+大腦中動脈栓塞組(EP+MCAO組)。

1.2.2 MCAO小鼠模型制備方法：MCAO組和EP+MCAO組參照文獻[14]采用Zea-Longa法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型。使用氯胺酮麻醉大鼠，頸部備皮，消毒，做頸部正中切口，暴露右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，在距離頸總動脈分叉處3 mm處的頸外動脈上剪一個小口將線栓向內插入到大腦中動脈，90 min后拔除線栓，絲線結扎頸外動脈近心端，縫合頸部傷口。兩組在拔除線栓后分別靜脈注射0.9%氯化鈉溶液或EP溶液(批號E822646)。Sham組僅暴露頸外動脈而不置入線栓，并與其他兩組在同一時間靜脈注射0.9%氯化鈉溶液。

1.3 觀察指標

1.3.1 神經功能缺損評價：分別于模型制作成功后24、48、72 h時，根據文獻[15]采用神經功能缺損評分(NSS)評估大鼠神經功能受損的程度：0分，無神經功能缺損；1分，損傷側前爪不能完全伸展；2分，行走時，大鼠向損傷側轉圈；3分，行走時，大鼠身體向損傷側傾倒；4分，不能自拔行走，有意識喪失。深麻醉下處死大鼠，0.9%氯化鈉溶液灌注后取腦，在冰箱中速凍20 min，根據文獻[8]報道的方法切為5～6片，進行TTC染色，評估腦梗死容積。

1.3.2 酶聯免疫法(ELISA)測定炎癥因子釋放：在造模成功后24、48、72 h時，深麻醉下處死大鼠，斷頭取腦，勻漿后4 ℃下10 000 r/min 離心5 min，離心半徑13.5 cm，取上清液檢測IL-1β、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)及腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的濃度。嚴格按照各指標ELISA試劑盒(美國R&D公司)說明書進行操作。

1.3.3 免疫熒光染色標記一氧化氮合酶陽性和精氨酸酶-1陽性小膠質細胞：取損傷側腦組織，制備石蠟切片，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，抗原修復和山羊血清封閉液孵育后，滴加兔抗鼠誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)(英國Abcam公司，1∶150稀釋)或精氨酸酶-1(Arginase-1，Arg-1)(英國Abcam公司，1∶100稀釋)抗體工作液4 ℃孵育過夜；洗去一抗工作液后滴加FITC標記的羊抗兔二抗工作液(北京中杉金橋生物技術有限公司，1∶500稀釋)避光孵育2 h，棄去二抗工作液后滴加DAPI染液襯染細胞核，中性樹脂封片，避光保存。在熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)下隨機采集5個400倍視野，分別在標記iNOS陽性和Arg-1陽性小膠質細胞的切片中，計數該視野內標記綠色熒光細胞數和總細胞數，分別取平均值并計算標記綠色熒光細胞占視野內總細胞數的百分比。

1.3.4 Western blot法檢測iNOS和Arg-1的表達水平：取損傷側大鼠腦組織，加入RIPA裂解液(北京百奧萊博科技有限公司)在冰上勻漿，于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，取上清液進行總蛋白定量，加入5×上樣緩沖液(北京百奧萊博科技有限公司)煮沸制備蛋白樣品。經SDS凝膠電泳，轉膜完成后，將聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜放入5%脫脂奶-TBS溶液中室溫下封閉4 h，分別加入免抗鼠iNOS(英國Abcam公司，1∶1000稀釋)或Arg-1(英國Abcam公司，1∶1000稀釋)抗體工作液4 ℃孵育過夜；洗去一抗工作液后使用辣根過氧化酶標記的羊抗兔二抗工作液(北京中杉金橋生物技術有限公司，1∶5000稀釋)室溫下孵育2 h，洗去二抗工作液后進行化學發光顯影，采集圖像，測定各條帶的灰度值，計算目的條帶與內參條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

2 結 果

2.1 三組大鼠造模后各時間點NSS評分比較 與Sham組比較，MCAO組和EP+MCAO組造模后各時間點NSS升高(均P<0.05)；與MCAO組比較，EP+MCAO組NSS降低(均P<0.05)。見表1。

表1 三組大鼠造模后各時間點NSS評分比較(分)

2.2 三組大鼠造模后各時間點腦梗死容積比較 與Sham組比較，MCAO組和EP+MCAO組腦梗死容積升高(均P<0.05)；與MCAO組比較，EP+MCAO組腦梗死容積降低(P<0.05)。見表2。

表2 三組大鼠造模后各時間點腦梗死容積比較(mm3)

2.3 三組大鼠造模后各時間點炎癥因子濃度比較 與Sham組比較，MCAO組和EP+MCAO組IL-1β、IL-6、IL-10、BDNF濃度升高(均P<0.05)；與MCAO組比較，IL-1β和IL-6濃度降低(均P<0.05)，IL-10、BDNF濃度升高(均P<0.05)。見表3。

表3 三組大鼠造模后各時間點炎癥因子濃度比較(pg/ml)

2.4 三組大鼠造模后各時間點小膠質細胞極化標志物水平比較 與Sham組比較，MCAO組和EP+MCAO組iNOS和Arg-1表達上調(均P<0.05)；與MCAO組比較，EP+MCAO組iNOS表達下調，Arg-1表達上調(均P<0.05)。見表4。

表4 三組大鼠造模后各時間點小膠質細胞極化標志物水平比較

3 討 論

本研究參照文獻[9]Zea-Longa法制備大鼠MCAO模型，結果表明，與Sham組比較，MCAO組NSS升高，腦梗死容積增大，提示大鼠MCAO模型制備成功。本研究根據前期預實驗結果，選擇4 mg/kg為丙酮酸乙酯的給藥劑量，結果表明，與MCAO組比較，EP+MCAO組NSS降低，腦梗死容積減小，提示丙酮酸乙酯減輕了大鼠腦缺血再灌注損傷。

缺血后炎癥通過一系列細胞事件導致缺血性損傷，包括循環免疫細胞的浸潤、常駐細胞(包括小膠質細胞和星形膠質細胞)和內皮細胞的激活。據報道，在這些細胞中，小膠質細胞通過釋放各種細胞毒性分子，如一氧化氮、氧自由基和細胞因子，以及對促炎細胞因子的反應，發揮著至關重要的作用[16]。小膠質細胞在靜息狀態下不斷監測神經元活動和穩態的改變，當有病原體侵入、組織損傷或異常蛋白質及核苷酸等物質存在的情況下，小膠質細胞迅速活化，根據其所處微環境不同，可極化為M1型，釋放IL-1β、IL-6等多種炎性因子，介導中樞神經系統炎性反應，或M2型，釋放IL-10和BDNF等多種物質，抑制炎性反應擴散[17]，促進細胞碎片吞噬和組織修復，即小膠質細胞的“雙刃效應”[18-19]。其中 iNOS為M1型標志物之一，Arg-1為M2型標志物之一[20]。本研究分別采用免疫熒光染色方法和Western blot法檢測缺血側腦組織iNOS和Arg-1的表達水平，采用ELISA方法檢測大鼠損傷側腦組織勻漿中炎性因子IL-1β、IL-6、IL-10的濃度，以及促進組織修復的重要物質BDNF的濃度。結果表明，丙酮酸乙酯可明顯下調iNOS的表達，抑制促炎因子IL-1β、IL-6的生成，上調Arg-1的表達，增加抑炎因子IL-10和BDNF的生成，促進小膠質細胞極化表型由M1型向M2型轉化，提示丙酮酸乙酯減輕MCAO后大鼠腦缺血再灌注損傷的機制可能與調控小膠質細胞極性轉化有關。

丙酮酸是生物體新陳代謝過程非常重要的一個中間產物，處在糖的無氧酵解和有氧氧化的連接點上，能改善休克狀態下線粒體功能，保護糖代謝，提高細胞對缺氧的耐受能力。丙酮酸乙酯抗炎作用的持久性以及活性表明，丙酮酸乙酯可以共價修飾細胞內成分，從而導致細胞對促炎細胞因子的反應持續改變，雖然它是一個非常簡單的分子，但丙酮酸乙酯在氧化還原和炎癥介導的細胞或組織損傷的各種體外和體內模型系統中具有藥理活性。丙酮酸乙酯的保護作用是由于其抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡和離子螯合作用。已經提出了各種分子機制來解釋其抗炎作用。Sims等[21]研究發現，丙酮酸乙酯乳酸林格氏液可減輕大鼠腸缺血再灌注損傷。Yang等[22]發現丙酮酸乙酯可下調出血性休克小鼠肝臟和腸黏膜組織炎癥相關轉錄因子:核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)的表達，抑制多個促炎因子的釋放，降低模型動物死亡率，NF-κB已被證明可調節 100 多個基因的轉錄，其中許多基因與程序性細胞死亡、氧化應激和炎性反應有關[16]。Jun等[23]發現丙酮酸乙酯對高血糖下的缺血再灌注損傷具有腎臟保護作用。此外，丙酮酸乙酯還通過抑制小膠質細胞激活發揮抗炎作用，NF-κB的DNA 結合活性和隨后的下游促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的產生。本研究的結果表明丙酮酸乙酯可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機制可能與調控小膠質細胞M1/M2極化表型轉化，抑制中樞炎性反應，促進缺血后損傷修復有關。

綜上所述，丙酮酸乙酯可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機制可能與調控小膠質細胞極化表型轉化，抑制中樞炎性反應有關。