震顫同系物-5過表達對卵巢癌細胞A2780增殖和凋亡的影響

段小霞，郭 華，付 婷，晉雅凌，周 卓

(1.陜西省第四人民醫院婦產科，陜西 西安710043；2.西安市中心醫院呼吸與危重癥醫學科，陜西 西安710004)

卵巢癌是常見的女性惡性腫瘤之一，因為其臨床癥狀模糊和早期難以被及時診斷而被稱為沉默的殺手[1]。截至2018年，每年卵巢癌新增病例約為240 000例，在女性惡性腫瘤發病率中位列第11位，而致死率位列第5位。在歐美國家40歲以上的女性中，卵巢癌是僅次于乳腺癌的第2大常見惡性腫瘤[2]。僅在美國，每年就有超過22 000例新增卵巢癌病例，其中14 000例癌癥死亡患者與卵巢癌有關，而在我國卵巢癌的發病率和致死率也呈現逐年遞增的趨勢[3]。最新研究表明卵巢癌5年存活率僅為47.4%，這主要是因為超過50%的卵巢癌患者初診時疾病已進展至晚期[4-6]。目前，卵巢癌的主要治療手段仍然是手術及術后輔助化療[7]。雖然在一定時間內延緩了病情的進展，但部分患者仍然面臨疾病復發和轉移的風險[8]。因此，探索更多、更有效的早期診斷生物標志物和治療靶點對于改善卵巢癌預后和突破現有治療手段的瓶頸具有重要意義。震顫同系物(Quaking homologue,QKI)屬于RNA結合信號轉導和RNA激活(Signals transductions activators of RNAs,STAR)蛋白家族成員[9]。QKI基因通過選擇性剪接產生三種主要轉錄產物，分別是Quaking homologue-5,-6,-7(QKI-5、QKI-6、QKI-7)[10]。QKI-5是胚胎發生過程中表達的主要核同種型，其表達在出生后下降，而QKI-6和QKI-7同種型在胚胎發生的晚期表達，表達峰值出現在髓鞘形成過程中[11]。這些同種型由于過早的mRNA選擇性剪接而具有不同的碳末端。既往研究表明QKI-5能夠在多種腫瘤中發揮抗腫瘤活性。例如，QKI-5能夠通過抑制內收蛋白3(Adducin 3,ADD3)第14外顯子的剪接從而抑制肺癌細胞的增殖和遷移[12]。QKI-5甲基化水平的增高使得其在前列腺癌中表達水平異常降低，過表達QKI-5后前列腺癌細胞增殖出現延緩，同時凋亡率出現明顯增加[13]。QKI-5在卵巢癌組織中也被證實出現異常的表達水平降低[14]，但進一步闡述其在卵巢癌中抗腫瘤活性的相關研究還尚未見報道。綜上所述，我們推測QKI-5很可能在卵巢癌的發生發展中發揮了一定的作用，因此本研究采用慢病毒介導的方式在卵巢癌細胞株A2780中擴增了QKI-5的表達豐度，通過一系列實驗驗證過表達的QKI-5對A2780細胞增殖和凋亡的影響，并初步地探討了可能涉及的機制，為探索更多卵巢癌的治療靶點提供了新的思路和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人卵巢癌細胞株A2780、SKOV3、HO-8910以及人正常卵巢上皮細胞株IOSE-80均為本院檢驗科實驗室保存。洛斯維·帕克紀念研究所1640(Roswell park memorial institute 1640,RPMI 1640)培養基，胰酶均購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物有限公司。QKI-5單克隆鼠抗人抗體購自Sigma公司，多克隆兔抗鼠熒光二抗購自蘇州宇恒生物科技有限公司，過表達QKI-5慢病毒購自廣州輝園苑醫藥科技有限公司。蛋白裂解液購自北京百奧萊博科技有限公司，細胞增殖和毒性分析(Cell counting kit-8,CCK8)試劑盒購自上海尚寶生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：液氮取出凍存細胞，37 ℃水浴鍋復蘇后800 r/min離心，棄上清后使用含10%FBS的RPMI 1640培養基重懸，平放于5% CO2、37 ℃恒溫孵箱培養，間隔4 h觀察細胞貼壁情況，待細胞生長至培養瓶底部面積90%時進行傳代或凍存。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達：取對數期生長細胞，常規消化離心后加入蛋白裂解液冰上裂解15 min，收集蛋白裂解液12 000 r/min離心10 min，棄上清液后取10 μg蛋白進行定量，其余蛋白樣品放入-20 ℃保存。分別制備上下層膠，安裝電泳設備后插入上下層膠，加入電泳液至上下層膠同水平層面，計算蛋白溶度后取蛋白樣品加入，補齊體積后開始電泳。電泳結束后進行轉膜，轉膜時間1 h，硝酸纖維素(NC)膜蘇木紅染色，加入PBS搖床脫色3次，5 min/次。按目的條帶位置選擇合適比例裁剪NC膜，脫脂牛奶封閉5 h，洗脫后滴加一抗4 ℃過夜，熒光二抗室溫孵育2 h，滴加顯色液，發光儀采集蛋白條帶圖片，實驗重復3次，記錄灰度值強度并進行統計學分析。

1.2.3 慢病毒感染：為了充分驗證實驗效果和排除載體本身可能對實驗結果產生的影響，將實驗分為三組，分別是：空白對照組、空載體對照組和過表達QKI-5組。選取對數期生長細胞，常規消化離心后按照1×106細胞數量加入6孔板中，觀察4～6 h待細胞完全貼壁后移除培養基。空白對照組中加入500 μl新鮮無血清培養基，空載體對照組中加入500 μl不具備過表達效果的空載體病毒原液，過表達QKI-5組加入500 μl慢病毒原液，各組均補充新鮮培養基至3 ml。常規孵育12 h后熒光倒置顯微鏡觀察感染效率，移除培養液，更換新鮮培養基繼續培養6 h。滴加殺瘟稻素進行篩選，重復上述步驟直至感染效率超過90%。通過Western blot觀察目的基因表達水平變化以此驗證穩定感染細胞株構建效果。

1.2.4 CCK8實驗：首先將細胞懸液進行細胞計數，按照3×102個細胞數滴入96孔板中并用培養基補齊至150 μl，共設6個重復孔。實驗分為三組：空白對照組、空載體對照組和過表達QKI-5組。常規條件下孵育1 d，各組待測孔中分別加入8 μl CCK8溶液，酶標儀450 nm處檢測吸光度，記錄數據。按上述相同步驟，分別在不同時間節點(第2、3、4、5、6、7 天)重復測量吸光度數值。統計測量數值并繪制增殖曲線。

1.2.5 平板克隆實驗：實驗分為三組：空白對照組、空載體對照組和過表達QKI-5組。按照實驗預定分組分別制備細胞懸液進行細胞計數后，6孔板中按照2×102細胞數加入細胞懸液。新鮮培養基補齊至5 ml，放入恒溫孵箱孵育。12 h觀察一次確定細胞正常孵育，每2 d更換一次新鮮培養基，7 d后停止孵育。吸棄培養基，細胞固定液室溫條件下固定15 min，自然干燥后吉姆薩染液染色30 min，自來水輕柔漂洗2次，采集圖片后計算每孔中克隆菌落的數量進行統計學分析。

1.2.6 凋亡檢測：收集對數期生長細胞，PBS洗脫培養基后制備細胞懸液。實驗分為三組：空白對照組、空載體對照組和過表達QKI-5組，按照實驗預定分組分別進行細胞計數后按照2×105個細胞數加入各組。每組細胞樣品中加入膜聯蛋白-V(Annexin-V)6 ml和碘化丙啶(PI)12 ml避光染色15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，FLOWJO軟件生成圖像并進行統計學分析。

2 結 果

2.1 不同卵巢癌細胞株中QKI-5表達水平比較 與正常卵巢上皮細胞IOSE-80相比三株卵巢癌細胞中QKI-5的表達水平明顯減少。在三株癌細胞中QKI-5的表達水平從高至低依次為SKOV3、HO-8910、A2780(均P<0.05)。因此，選擇QKI-5相對表達水平最低的A2780進行過表達慢病毒感染。見圖1。

注：與IOSE-80比較，*P<0.05，△P<0.01

2.2 構建穩定過表達QKI-5的A2780細胞 慢病毒感染及殺瘟稻素進行篩選后構建了穩定過表達QKI-5的A2780細胞，通過Western blot實驗檢測感染效果，實驗結果顯示：與空白對照組及空載體對照組相比，過表達QKI-5組中QKI-5基因的表達水平顯著增高(P<0.01)，見圖2。

注：與空白對照組比較，△P<0.01

2.3 過表達QKI-5對A2780細胞增殖的抑制作用 為了驗證過表達QKI-5對A2780細胞增殖的抑制作用，采用CCK8實驗進行檢測，實驗結果顯示：與空白對照組和空載體對照組相比較，過表達QKI-5組細胞增殖出現了明顯抑制(P<0.01)。隨著時間的延長這種增殖抑制效應呈現更加顯著的趨勢。見圖3。

注：與空白對照組比較，△P<0.01

2.4 過表達QKI-5對A2780細胞克隆形成的影響 平板克隆實驗結果顯示：過表達QKI-5組的克隆形成率為(29.33±5.79)%，空載體對照組為(65.67±6.34)%，空白對照組為(62.00±6.38)%。過表達QKI-5組的克隆形成率相對比兩個對照組出現了明顯的抑制(P<0.001)，而空載體對照組和空白對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

注：與空白對照組比較，#P<0.001

2.5 過表達QKI-5能夠增加A2780細胞的凋亡率 流式細胞儀檢測不同實驗組間的細胞凋亡率差異，實驗結果顯示：過表達QKI-5組的細胞凋亡率為(7.10±0.455)%，空載體對照組為(3.13±0.805)%，空白對照組為(2.87±0.330)%。分別將過表達QKI-5組的細胞凋亡率與其他兩組進行比較，結果顯示過表達QKI-5組的細胞凋亡率相比其他兩組出現增高趨勢(P<0.05)，提示過表達QKI-5可以增加卵巢癌細胞A2780的凋亡水平。見圖5。

注：與空白對照組比較，△P<0.01

3 討 論

卵巢癌的早期診斷和現有治療方法的突破目前仍然是臨床難題，超過50%的卵巢癌患者在初診時已經處于疾病晚期[15-17]。而晚期卵巢癌患者更容易出現廣泛的腹部轉移從而具有較高的病死率。盡管采用現代治療方法，相當一部分女性獲得完全緩解，但大多數晚期疾病患者將在18個月內復發。早期的診斷和有效的篩查對于降低卵巢癌病死率具有積極的意義。然而，目前尚不存在早期發現卵巢癌的有效篩查策略，但存在卵巢癌高危人群，例如乳腺癌1號基因(Breast cancer 1,BRCA1)或乳腺癌2號基因(Breast cancer 2,BRCA2)或其他與卵巢癌高風險相關的基因的種系突變。對于此類人群，降低卵巢癌風險的策略是通過低風險的手術來實施的，例如雙側輸卵管卵巢切除術(切除卵巢和輸卵管)。對卵巢癌平均風險女性的篩查策略主要集中在生物標志物CA125和經陰道超聲檢查的使用上。這些篩查模式的組合已顯示出在檢測早期癌癥方面的優勢，但尚未證明患者病死率的確切改善。此外，近年來卵巢癌的診療技術也取得了一定的進展，但患者5年生存率仍然不足50%，嚴重威脅著女性生命健康[18-19]。在腫瘤領域隨著診斷技術和治療靶點的不斷進步和發展，越來越多的生物標志物和治療靶點被應用于臨床并取得了良好的診療效果，例如在卵巢癌中同時阻斷程序性死亡受體1(Programmed cell death protein 1,PD-1)和細胞程序性死亡-配體1(Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)免疫檢查點能夠增強高級別漿液性卵巢癌中的療效。PD-1及其配體PD-L1是刺激免疫檢查點通路的分子，以此為靶點的免疫治療整合和改變了既往非小細胞肺癌的治療方式，對患者產生了快速的治療反應并延長了患者的生存時間。此外還有例如黑色素瘤、腎癌等多種腫瘤中以PD1，PDL-1為靶點的免疫治療的應用，以及乳腺癌中針對人表皮生長因子受體-2(Human epidermal growthfactor receptor 2,HER2)基因的靶向治療等[20]。關于如何尋找早期診斷卵巢癌的生物標志物和探索有效的治療靶點一直都是卵巢癌研究領域的關注熱點。

RNA結合蛋白QKI屬于RNA蛋白家族的信號轉導和激活STAR家族成員之一，是一個關鍵的轉錄后調節因子，參與多種癌癥調節機制，包括胃癌、乳腺癌和前列腺癌等。最近的研究結果表明，QKI-5的基因組缺失增加了癌細胞的增殖和去分化，這表明QKI-5是許多癌癥類型的腫瘤抑制因子。結合既往的研究結果，RNA結合蛋白QKI-5已被證實在多種癌癥表現出抗腫瘤活性，是一個潛在的候選抑癌基因。QKI-5表達水平的變化與前列腺癌細胞的增殖、分化以及細胞周期阻滯密切關聯，同時高表達QKI-5的前列腺癌患者擁有更好的預后[13]。此外，QKI-5還能夠通過MAPK信號通路抑制Cyclin D1的表達從而抑制口腔鱗癌細胞的增殖[21]。在卵巢癌中QKI-5的表達水平也出現了異常的降低，并且這種表達水平的降低與卵巢癌分期分級等臨床病理特征密切關聯。在我們的研究中，首先與正常卵巢細胞相比三株卵巢癌細胞中QKI-5的表達水平都出現了降低，這與前期的研究結果相一致。選取QKI-5表達水平相對最低的A2780細胞作為過表達慢病毒感染的對象，通過慢病毒感染和殺瘟稻素進行篩選最終成功構建了穩定過表達QKI-5的A2780細胞系。CCK8和平板克隆實驗結果表明，過表達QKI-5能夠顯著抑制A2780細胞的增殖和克隆形成能力。而流式細胞儀凋亡檢測證實，過表達QKI-5能夠促進A2780細胞的凋亡水平。

綜上所述，本研究證實了在相對低表達QKI-5的卵巢癌細胞A2780中擴增RNA結合蛋白QKI-5后，A2780細胞的增殖和克隆能力出現了明顯的抑制，而細胞的凋亡水平則出現了顯著的增高。卵巢癌細胞的增殖在細胞學和分子水平被證實得到了抑制，這為卵巢癌的治療提供了新的靶點和理論基礎。