高遷移率族蛋白B1過表達(dá)對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響及機(jī)制研究

趙 瑾，胡海燕，周艷紅

(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710038)

子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，是指原發(fā)于子宮內(nèi)膜的一種上皮性惡性腫瘤,占女性生殖道惡性腫瘤1/4左右[1]。子宮內(nèi)膜癌多見于圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)后婦女，隨著人口的老齡化與體檢人群的擴(kuò)大，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病人數(shù)逐年增加，已成為一種比較嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[2]。手術(shù)為子宮內(nèi)膜癌的首選治療方法，能顯著提高患者的生存率。但是由于各種因素的影響，很多子宮內(nèi)膜癌患者在發(fā)病時已確診為中晚期子宮內(nèi)膜癌，預(yù)后較差[3]。為此在臨床上與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)上需要進(jìn)一步研究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制，從而有利于尋找更好的子宮內(nèi)膜癌治療靶點(diǎn)[4]。現(xiàn)代研究[5-6]表明，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展周期比較長，涉及的關(guān)鍵因子比較多，包括抑癌基因失活、細(xì)胞增殖失衡、細(xì)胞凋亡失衡、癌基因激活等。高遷移率族蛋白(High mobility group protein，HMG)為一種DNA結(jié)合非組蛋白，最先發(fā)現(xiàn)于牛胸腺細(xì)胞。HMGB1為HMG的主要家族成員，是一種重要的促炎性細(xì)胞因子[7]。在機(jī)體受到內(nèi)外在各種因素的刺激時，HMGB1的表達(dá)量會顯著增加。B細(xì)胞特異性小鼠白血病病毒插入位點(diǎn)1(B-cell-specific moloney murine leukemia virus insertion site 1，Bmi-1)屬于多梳蛋白單位，可影響細(xì)胞染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而影響細(xì)胞的生長、增殖與凋亡等[8-9]。本文探討了HMGB1過表達(dá)對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響，并闡述了相關(guān)機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(Ishikawa細(xì)胞)購自于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫，100 U/ml青霉素(批號83516333)、0.1 mg/ml鏈霉素(批號184726222)、0.25%胰蛋白酶(批號28384414)購自Invitrogen公司，RPMI-1640培養(yǎng)基(批號72737214)購自Gibco公司，胎牛血清(批號8232176)購自Sciencell公司，pcDNA3.0-HMGB1載體與pcDNA3.0載體保存本院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染：Ishikawa細(xì)胞均采用RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)(100 U/ml青霉素+0.1 mg/ml鏈霉素+10%胎牛血清)進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2。Ishikawa細(xì)胞(對數(shù)生長期)隨機(jī)平分為三組:pcDNA3.0組、pcDNA3.0-HMGB1組與對照組。pcDNA3.0組、pcDNA3.0-HMGB1組分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.0載體與pcDNA3.0-HMGB1載體，轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L；對照組以等體積的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前12 h，于96孔培養(yǎng)板接種Ishikawa細(xì)胞。用250 μl磷酸鹽緩沖液稀釋5 μl Lipo2000 Transfection Reagen，靜置5 min。然后用25 μl 磷酸鹽緩沖液稀釋pcDNA3.0-HMGB1載體或pcDNA3.0載體，孵育5 min后混合Lipo2000 Transfection Reagen稀釋液，滴入RPMI-1640培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染后6 h換液1次。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖指數(shù)：轉(zhuǎn)染后將對數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞接種于無菌的96孔板中(密度為3×105細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)24 h后然后每孔加入5 mg/ml的20 μl MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入200 μl的二甲基亞砜，在振蕩器上進(jìn)行避光振蕩溶解10 min，測定與計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期：轉(zhuǎn)染后將對數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞接種于無菌的6孔板中，采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行避光染色60 min，采用流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)。轉(zhuǎn)染后將對數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞接種于無菌的6孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入70.0%乙醇重懸細(xì)胞，4 ℃固定過夜，然后加入100.0 mg/L的碘化丙啶染色液，孵育15 min后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.4 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移指數(shù)：轉(zhuǎn)染后將對數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞接種于Transwell小室的上室中(1×105細(xì)胞/孔)，Transwell小室下室加入常規(guī)培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h后取出Tranawell小室，進(jìn)行甲醛固定，然后加入0.1%結(jié)晶紫染色30 min，計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)移指數(shù)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)前24 h將基質(zhì)膠置于室溫下溶解，小室內(nèi)加入基質(zhì)膠100 μl，后續(xù)處理同細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，計(jì)算細(xì)胞侵襲指數(shù)。

1.2.5 Western blot法檢測蛋白表達(dá)：轉(zhuǎn)染后將對數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，定量蛋白濃度后進(jìn)行蛋白電泳，采用Western blot法檢測Bmi-1、HMGB1表達(dá)水平(一抗稀釋濃度為1∶1000；二抗稀釋濃度為1∶2000，一抗孵育時間為12 h，二抗孵育時間為1 h)，以β-actin作為內(nèi)參，曝光后記錄與計(jì)算Bmi-1、HMGB1蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 三組細(xì)胞增殖指數(shù)與凋亡指數(shù)對比 轉(zhuǎn)染后36、72 h，pcDNA3.0-HMGB1組的細(xì)胞增殖指數(shù)高于pcDNA3.0組與對照組(均P<0.05)，細(xì)胞凋亡指數(shù)低于pcDNA3.0組與對照組(均P<0.05)，見表1。

表1 三組細(xì)胞增殖指數(shù)與凋亡指數(shù)對比(%)

2.2 三組細(xì)胞周期比例對比 轉(zhuǎn)染后36、72 h，pcDNA3.0-HMGB1組的G0/G1期比例高于pcDNA3.0組與對照組(均P<0.05)，S期和G2/M期比例低于pcDNA3.0組與對照組(均P<0.05)，見表2。

表2 三組細(xì)胞周期比例對比(%)

2.3 三組細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移指數(shù)對比 轉(zhuǎn)染后36、72 h，pcDNA3.0-HMGB1組的細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移指數(shù)高于pcDNA3.0組與對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。

表3 三組細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移指數(shù)對比(%)

2.4 三組Bmi-1、HMGB1蛋白相對表達(dá)水平對比 轉(zhuǎn)染后36、72 h，pcDNA3.0-HMGB1組的Bmi-1、HMGB1蛋白相對表達(dá)水平高于pcDNA3.0組與對照組(均P<0.05)，見表4。

表4 三組Bmi-1、HMGB1蛋白相對表達(dá)水平對比

3 討 論

由于各種因素的影響，近年來子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年增高，部分患者在出現(xiàn)癥狀時才進(jìn)行就診，多數(shù)此時已確診為中晚期子宮內(nèi)膜癌，導(dǎo)致預(yù)后比較差，也使得1年生存率與5年生存率一直居高不下[10]。此早期發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌侵襲及轉(zhuǎn)移的分子和信號通路具有重要價值[11]。HMGB1為一種轉(zhuǎn)錄細(xì)胞因子，也為一種炎癥因子和損傷信號分子之一，HMGB1可介導(dǎo)炎性級聯(lián)反應(yīng)從而導(dǎo)致組織發(fā)生損傷[12-13]。HMGB1能與特定的靶基因轉(zhuǎn)錄序列結(jié)合，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而誘導(dǎo)IκB磷酸化降解。HMGB1均在子宮內(nèi)膜癌組織中均存在異常高表達(dá)，靶向抑制HMGB1的表達(dá)可以顯著抑子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡。本研究顯示轉(zhuǎn)染后36、72 h，pcDNA3.0-HMGB1組的細(xì)胞增殖指數(shù)高于pcDNA3.0組與對照組,細(xì)胞凋亡指數(shù)低于pcDNA3.0組與對照組，表明HMGB1過表達(dá)能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展過程比較復(fù)雜，涉及腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡。腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡是相互調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，也受到細(xì)胞周期的調(diào)控[14-15]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后36、72 h，pcDNA3.0-HMGB1組的G0/G1期比例高于pcDNA3.0組與對照組,S期和G2/M期比例低于pcDNA3.0組與對照組,表明HMGB1過表達(dá)能調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期。從機(jī)制上分析，HMGB1與腫瘤組織的血管生成存在相關(guān)性，由215個氨基酸組成，廣泛分布于肝臟、腎臟、肺臟、心臟等部位[16]。HMGB1的過表達(dá)可通過活化細(xì)胞的主動分泌或壞死細(xì)胞被動釋放進(jìn)入胞外，從而激發(fā)機(jī)體出現(xiàn)過量炎性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，促進(jìn)腫瘤組織血管生成[17-18]。

在人體內(nèi)的子宮內(nèi)膜癌發(fā)生以及發(fā)展過程中，腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移可能具有十分關(guān)鍵的作用。腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移是子宮內(nèi)膜癌發(fā)展與惡化的重要表現(xiàn)，也是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌患者病情惡化的主要因素[19-20]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后36、72 h，pcDNA3.0-HMGB1組的細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移指數(shù)高于pcDNA3.0組與對照組，表明HMGB1過表達(dá)能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。HMGB1為調(diào)控基因復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄等過程的重要蛋白，可被壞死或受損細(xì)胞被動釋放至胞外,并引發(fā)炎癥，導(dǎo)致機(jī)體病情惡化。本研究顯示轉(zhuǎn)染后36、72 h，pcDNA3.0-HMGB1組的Bmi-1、HMGB1蛋白相對表達(dá)水平高于pcDNA3.0組與對照組，表明HMGB1過表達(dá)能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Bmi-1蛋白的表達(dá)。由于經(jīng)費(fèi)限制，本研究沒有進(jìn)行抑制HMGB1表達(dá)的分析，也沒有進(jìn)行靶基因分析，將在后續(xù)研究中探討。

總之，HMGB1過表達(dá)能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及Bmi-1蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。