參芍口服液抑制NLRP3炎癥小體改善創(chuàng)傷性腦損傷小鼠炎性反應(yīng)實驗研究

李寶福,劉柏麟,袁 興,郝璞珩,鄧齊奇,孫皖秦

(西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 西安 710100)

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)具有患病率高、病情多變、致死致殘率高的特點；且因其治療費用昂貴，傷后多發(fā)終身性認(rèn)知障礙，預(yù)后較差，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，一直以來給患者家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)，是臨床實踐與公共衛(wèi)生事業(yè)中亟待突破的問題之一[1-2]。TBI由原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷組成；繼發(fā)性損傷的病理機(jī)制復(fù)雜，包括腦水腫、興奮性毒性、鈣超載、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎性反應(yīng)等[3]；傷后初期的神經(jīng)炎性反應(yīng)對神經(jīng)組織的恢復(fù)起積極作用，但后期強烈的炎性反應(yīng)又會對組織造成傷害[4]。參芍口服液在臨床上主要用于冠心病的治療，有降低血稠，增加冠腦血流量的作用[5]；近期也有研究指出參芍口服液對部分炎性反應(yīng)有治療效果，如參芍口服液可以減輕小鼠2型糖尿病引起的肝臟和心肌的炎癥損傷等[6-7]；但是目前有關(guān)參芍口服液是否能對TBI的繼發(fā)性炎性反應(yīng)發(fā)揮作用的研究仍未見報道，因此本文旨在探討參芍口服液對TBI后炎性反應(yīng)的作用，并嘗試解釋其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物為空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心8～10周齡C57雄性小鼠54只，體重20～24 g，飼養(yǎng)時保持室溫20～25 ℃，濕度40%～60%，每日光照12 h，不限食水；預(yù)先適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：54只C57小鼠完全隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(Sham組)、TBI組和參芍口服液組(SS組)；每組中，6只用以評估改良的神經(jīng)功能評分和受損組織中的細(xì)胞凋亡情況，6只用于酶聯(lián)免疫吸附法檢測炎癥因子表達(dá)水平，6只用于蛋白印跡法檢測NLRP3炎癥小體通路相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1的表達(dá)情況。

1.2.2 模型建立：小鼠稱重后，制作小鼠控制性皮層損傷(CCI)模型，選用10%水合氯醛作為麻醉劑，注射入小鼠腹腔進(jìn)行麻醉。將麻醉后的小鼠俯臥置于立體定位儀上，對小鼠頭部備皮剃毛，在頭皮正中剪開長1.2 cm的切口，取前囟點與后囟點正中左側(cè)4 mm為圓心，鉆開直徑5 mm的圓形骨窗。將撞擊錘的打擊頭放在骨窗內(nèi)，注意不要損傷硬腦膜。設(shè)置打擊參數(shù)：打擊深度2 mm,打擊角度垂直于腦皮質(zhì)表面,速度2 m/s,接觸時間100 s,打擊頭直徑4 mm。打擊致傷后還納骨瓣，縫合創(chuàng)口。Sham組鉆開骨窗后即還納骨瓣。模型建立6 h后，SS組給予5 ml參芍口服液灌胃干預(yù)，Sham組和TBI組用等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，各組均持續(xù)7 d。

1.2.3 mNSS神經(jīng)功能評分：于處理后第1、3、7天，對小鼠神經(jīng)功能進(jìn)行mNSS評分，依次進(jìn)行運動、感覺、反射和肌張力實驗，分?jǐn)?shù)越低則說明該小鼠的神經(jīng)功能缺損程度越輕。

1.2.4 ELISA檢測炎癥因子的含量：模型建立后第7天，取小鼠損傷區(qū)腦組織，低溫下加入PBS溶液勻漿，以適量超純水制備腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、IL-18的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行樣品稀釋，預(yù)實驗后按梯度將樣品加入酶標(biāo)板，室溫孵育1 h后洗滌3次。加入適宜量的對應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。加入Sterptavidin-HRP室溫避光孵育30 min，加入TMB Substrate室溫避光孵育30 min，最后加入Stop solution終止反應(yīng)，在試劑盒指示波長處進(jìn)行OD值檢測。用全波長掃描式讀數(shù)儀進(jìn)行檢測。用Skan It軟件讀取樣品光吸度收原始數(shù)據(jù)，處理得腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-18的含量。

1.2.5 TUNEL染色檢測神經(jīng)元凋亡：選用4%多聚甲醛為固定液，室溫下對小鼠損傷區(qū)腦組織切片進(jìn)行固定，棄去甲醛。選用3%過氧化氫-甲醇為封閉液,室溫封閉10 min。滴加0.5% Triton X-100完全覆蓋于切片上，孵育5 min。根據(jù)試劑盒說明書滴加適量的TUNEL反應(yīng)液，37 ℃避光反應(yīng)30 min。用DAB顯色后在鏡下觀察，檢測手術(shù)損傷后第7天各組小鼠神經(jīng)元凋亡情況。

1.2.6 蛋白印跡法檢測：于處理后第7天，以Western blot方法檢測小鼠皮層損傷區(qū)腦組織中NRLP3、Caspase-1的表達(dá)水平。小鼠麻醉后斷頭取腦，冰上分離目標(biāo)腦組織。用加有蛋白酶抑制劑的PBS清洗組織，完全棄去PBS后加入裂解液，冰上靜置30 min裂解。將裂解后的細(xì)胞勻漿后，按BAC法測蛋白濃度，取適量且等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯膜，切膜后用商品化封閉液封閉。再加入一抗如下：NLRP3(1∶1000)、Caspase-1(1∶2000)，4 ℃過夜。用TBST洗去未結(jié)合的一抗3次，用HRP 標(biāo)記的相應(yīng)山羊抗兔二抗 IgG(1∶3000)作為二抗孵育1 h。再次用TBST洗去未結(jié)合的二抗3次。加入顯影液，用Image J軟件計算Western blot圖片灰度值，再用Graphpad Prism數(shù)據(jù)量化作圖及對各灰度值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 參芍口服液減弱小鼠腦損傷模型的神經(jīng)功能損傷 于小鼠腦損傷模型制作后的第1、3、7天，分別對小鼠進(jìn)行mNSS評分，相較于Sham組，TBI組小鼠的評分平均值明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.05)。對比TBI組，SS組小鼠的評分的平均值明顯下降，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見圖1。

注：與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 參芍口服液降低腦損傷小鼠腦組織內(nèi)炎癥因子表達(dá)水平 在小鼠傷后的第7天，用ELISA法分別測得Sham組、TBI組和SS組傷處腦組織的炎癥因子含量。經(jīng)比較可知，TBI組的小鼠組織中的TNF-α、IL-1β、IL-18表達(dá)水平均高于Sham組(均P<0.05)；而對比TBI組的炎癥因子水平，SS組的TNF-α、IL-1β、IL-18濃度均明顯下降(均P<0.05)。見圖2。

注：與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 參芍口服液抑制小鼠腦損傷模型的細(xì)胞凋亡 對術(shù)后第7天的小鼠損傷處腦組織TUNEL染色，相較于Sham組，TBI組小鼠皮層損傷區(qū)的神經(jīng)元凋亡率升高明顯(P<0.05)。對比TBI組，SS組腦組織神經(jīng)元凋亡率明顯下降(P<0.05)。見圖3。

注：與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 參芍口服液下調(diào)創(chuàng)傷性腦損傷小鼠模型NLRP3炎癥小體的表達(dá) 以Western blot方法檢測損傷手術(shù)后第7天各組小鼠皮層組織的NRLP3和Caspase-1蛋白含量；比較各組數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，相比于Sham組，TBI組小鼠的皮層組織中NRLP3和Caspase-1蛋白表達(dá)顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；而SS組較之于TBI組，小鼠皮層組織的NRLP3和Caspase-1蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；表示參芍口服液能夠抑制TBI小鼠的NLRP3炎癥小體表達(dá)，有減輕炎癥損傷的作用。見圖4。

注：與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

作為創(chuàng)傷性腦損傷的繼發(fā)損傷中的重要一環(huán)，神經(jīng)炎性反應(yīng)的病理機(jī)制復(fù)雜，且炎性反應(yīng)與腦水腫、顱內(nèi)壓上升等繼發(fā)性損傷的其他癥狀的邏輯關(guān)系仍未知；研究顯示患者炎性反應(yīng)的劇烈程度與其預(yù)后水平有直接關(guān)系，因此對創(chuàng)傷性腦損傷后炎性反應(yīng)相關(guān)的診療方法的研究仍具有較強的現(xiàn)實意義。目前研究顯示神經(jīng)炎性反應(yīng)主要由小膠質(zhì)細(xì)胞引發(fā)；原發(fā)性損傷中腦組織產(chǎn)生的損傷因子激活小膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞活化后，主要表型最初為M2后向M1轉(zhuǎn)變，時間與繼發(fā)性損傷進(jìn)程相符[8]。小膠質(zhì)細(xì)胞的活化會加強血腦屏障通透性，募集免疫細(xì)胞，上調(diào)組織中細(xì)胞因子和炎性介遞表達(dá)[9]。有研究表明細(xì)胞因子TNF-α、IL-18等對創(chuàng)后神經(jīng)組織的恢復(fù)具有雙重效應(yīng)，隨著其濃度在組織中逐漸升高，其作用也從促進(jìn)神經(jīng)損傷恢復(fù)轉(zhuǎn)變?yōu)橐鸩⒓又匮仔苑磻?yīng)[10]。

參芍口服液是含有丹參、赤芍等成分的中藥復(fù)方制劑，臨床上對于冠心病心絞痛有顯著療效；目前有研究顯示，參芍口服液通過對TLR4/MyD88炎癥誘導(dǎo)通路的調(diào)控，可以改善糖尿病小鼠的心肌功能和炎癥損傷情況[11]；另有研究表明,參芍口服液能夠抑制CD4/TLR4通路,下調(diào)IL-8 的表達(dá)，從而減輕腦出血后的神經(jīng)炎癥[12]；相關(guān)研究提示參芍口服液能夠減少IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 的表達(dá)水平，發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)而阻礙冠狀動脈粥樣硬化的病程進(jìn)展[13]；但有關(guān)參芍口服液在創(chuàng)傷性腦損傷后炎性反應(yīng)的治療作用仍然缺少相關(guān)研究，因此本研究就此進(jìn)行討論并嘗試解釋相關(guān)機(jī)制。實驗結(jié)果顯示參芍口服液對治療創(chuàng)傷性腦損傷后的炎性反應(yīng)有效用。

本研究中采用小鼠限制性皮層損傷模型檢驗參芍口服液對創(chuàng)傷性腦損傷后的炎性反應(yīng)的作用。運用CCI模型,對皮層進(jìn)行精確損傷，可重復(fù)性強，且模型的創(chuàng)傷反應(yīng)與人類TBI的形態(tài)學(xué)表征較為類似，較其他模型制作的方式有更高的臨床意義[14]；且根據(jù)mNSS評分結(jié)果可知TBI組的神經(jīng)功能明顯受損，TBI模型建立成功。隨著實驗進(jìn)行，通過對比各組小鼠的mNSS評分和TUNEL染色結(jié)果可知，使用參芍口服液后小鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)情況較TBI組有明顯改善，說明參芍口服液對小鼠的創(chuàng)傷性腦損傷有治療作用；根據(jù)ELISA實驗得到各組炎癥因子的表達(dá)水平，檢測結(jié)果顯示SS組的細(xì)胞因子IL-18、TNF-α、IL-1β均明顯低于TBI組，顯示參芍口服液可以通過減緩炎性反應(yīng)保護(hù)小鼠的神經(jīng)功能。NLRP3在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中有調(diào)節(jié)作用，廣泛表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等，NLRP3可感知由多種炎癥激活劑引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)信號，進(jìn)而上調(diào)NLRP3炎癥小體的轉(zhuǎn)錄水平，推動NLRP3炎癥小體的組裝[15]；相關(guān)實驗證明，NLRP3炎癥小體可以參與創(chuàng)傷性腦損傷、阿爾茨海默癥、缺血性腦卒中等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病程進(jìn)展，且有臨床研究顯示，TBI患者腦脊液中的NLRP3濃度有指示預(yù)后的潛在效用；NLRP3炎癥小體的激活過程為大量實驗證明，創(chuàng)傷性腦損傷后6 h至傷后第7天，甚至傷后6個月NLRP3炎癥小體的表達(dá)都屬上調(diào)狀態(tài)[16]，同時，靶向創(chuàng)傷性腦損傷后NLRP3炎癥小體激活的各步驟抑制劑能夠有效減輕腦組織的炎癥損傷[17]；相關(guān)研究指出，NLRP3炎癥小體能夠促進(jìn)Pro-caspase1的自我剪切形成Caspase-1蛋白，Caspase-1蛋白又可以剪切IL-1β和IL-18的前體蛋白，產(chǎn)生大量的炎癥因子IL-1β和IL-18，進(jìn)而加劇炎性反應(yīng)[18-20]；相應(yīng)地，在本實驗中，以Western blot法檢測小鼠組織中NLRP3、Caspase-1蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，TBI組的NLRP3、Caspase-1含量明顯較Sham組高，而SS組的NLRP3、Caspase-1蛋白含量又明顯低于TBI組，說明參芍口服液抑制TBI后炎性反應(yīng)，改善小鼠的傷后神經(jīng)功能，可能與下調(diào)NLRP3炎癥小體表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，本實驗通過TBI模型建立，對比研究了參芍口服液對創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的治療作用，發(fā)現(xiàn)TBI組IL-18、TNF-α、IL-1β、NLRP3及Caspase-1等蛋白的表達(dá)較Sham組均有增加，而SS組較TBI組又有所下降，且SS組小鼠的mNSS評分、受創(chuàng)組織凋亡比例均明顯低于TBI組，提示參芍口服液可能通過抑制NLRP3炎癥小體表達(dá)的機(jī)制，減少組織炎癥因子含量，提高小鼠的創(chuàng)傷性腦損傷的恢復(fù)水平，改善神經(jīng)功能，降低神經(jīng)元死亡比例，進(jìn)而實現(xiàn)對小鼠創(chuàng)傷性腦損傷繼發(fā)損傷的治療。