急性腦梗死患者血清miR-34b表達及檢測臨床意義

王俐慧,蘇東風,隋汝波

(1.錦州醫科大學解放軍北部戰區空軍醫院研究生培養基地,遼寧 沈陽110042;2.錦州醫科大學附屬第一醫院,遼寧 錦州 121012)

急性腦梗死是缺血性的病變，其發生與動脈粥樣硬化有關，多見于老年人。本病具有致殘性疾病，同時也是影響老年人死亡的重要原因之一[1]。在急性腦梗死的早期，影像學常不能提示腦梗死灶，且患者病變較重時亦存在搬運的風險，因此疾病的早期診斷常不能完全依托于影像學[2]。近年學者關注到血清中一些指標在病變早期有改變，這也為臨床尋找特異性強、敏感性好的血清學指標提供了支持[3-4]。微小RNA(micrRNA,miR)是近年發現的一種非編碼短鏈RNA，其在多種疾病中異常表達，主要作用特征為調控下游的靶基因[5]。學者近年在神經系統的正常發育和病理過程中發現了不同miR的差異表達，亦在急性腦梗死患者血清和腦脊液中發現了部分miR的異常表達，認為miR的異常表達在急性腦梗死的發生發展中具有一定作用[6]。微小RNA-34b(microRNA-34b,miR-34b)是近年關注度較高的因子，在腫瘤細胞形成及神經細胞的缺血再灌注損傷的保護中可能具有一定作用[7]。生信分析顯示miR-34b 與CXC趨化因子配體12(CXC chemokine ligand-12,CXCL12)具有結合的位點，且CXCL12在急性腦梗死中常伴有較高的表達，是病變形成的促進因子。基于此本實驗檢測急性腦梗死患者血清中miR-34b和CXCL12 的表達特征，探討其相關性及臨床意義，以期為臨床診斷及治療提供幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象 患者均為2021年1月至2021年12月在我院確診并治療的急性腦梗死住院患者。病例納入標準：①初次發病；②確診后存活時間超過72 h；③均經CT或核磁確診。排除標準：①精神疾病史或頭顱部手術史；②血液系統疾病；③出血性腦卒中；④短暫性腦缺血發作；⑤近期有其他血栓性疾病，如心肌梗死、深靜脈血栓等。共納入87例作為觀察組。收集同期在我院進行體檢證實為無明顯器官質性疾病(主要是無心、腦血管疾病及特殊類型疾病)的成人血清(健康成人)87例作為對照組。研究經醫院倫理委員會批準同意，患者或家屬簽訂知情同意書。

1.2 血清中miR-34b和CXCL12的表達檢測 兩組均留取確診后的空腹靜脈血3 ml，3000 r/min離心15 min后將血清分離。應用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測血清中miR-34b的表達。試劑盒購自上海萊楓生物科技有限公司和美國ABI公司，引物由上海生工生物合成。應用Trizol提取總RNA，并進行濃度和純度的測定(OD260/280比值在1.8～2.1之間)。cDNA第一鏈合成(TaqMan microRNA反轉錄試劑盒)。miR-34b上游引物：5’-TGACAACCGTTTTT-TTGACTG-3’,下游：5’-TACTGTTTTGAAAATC-GTT-3’。以U6作為內參，上游引物：5’-GGAACAGAGAAAGATTAGC-3’，下游：5’-TTGGAATTCACGAATTCCG-3’。程序設定：95 ℃ 10 min，循環1次；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環，72 ℃延伸7 min。60 ℃采集熒光信號，記錄Ct值。應用羅氏Light Cycler480 Ⅱ PCR儀完成實驗，結果以2-ΔΔCT表示。應用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測血清中CXCL12的表達，試劑盒購自上海碧云天公司。操作均由同一技術人員完成，減少誤差，做好質控工作。

1.3 格拉斯哥預后(GOS)評分 于確診后30 d對患者進行的GOS的評分評定。GOS評分標準：死亡為1分；植物生存，僅有最小反應為2分；重度殘疾，日常生活需要照料為3分；輕度殘疾，但可獨立生活為4分；有輕度缺陷，但能正常生活為5分[8]。

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較 見表1。兩組年齡、性別、吸煙史和飲酒史等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。87例腦梗死患者，年齡50～88歲，平均年齡(67.34±7.36)歲，其中男47例，女40例，吸煙36例，不吸煙51例，梗死最大徑0.6～8.2 cm，平均(3.25±0.85)cm。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組miR-34b和CXCL12表達水平比較 見表2。觀察組中 miR-34b的表達水平明顯低于對照組[(1.06±0.25)與(1.32±0.34)，P<0.01]，CXCL12的表達水平明顯高于對照組[(19.47±3.26與(7.37±1.06),P<0.01]。

表2 兩組miR-34b和CXCL12表達水平比較

2.3 急性腦梗死患者血清中miR-34b、CXCL12表達對急性腦梗死的診斷價值 見圖1。miR-34b曲線下面積AUC為0.7187，95%置信區間(CI)：0.6427～0.7946。血清中miR-34b表達下調對急性腦梗死診斷具有預測價值。CXCL12曲線下面積AUC為0.9880，95%CI：0.9772～0.9988。血清中CXCL12表達上調對急性腦梗死診斷具有預測價值，且CXCL12的預測價值要優于miR-34b。

圖1 miR-34b(左)、CXCL12(右)表達對急性腦梗死診斷的ROC曲線

2.4 miR-34b和CXCL12在不同臨床特征中的表達差異 見表3。miR-34b在不同梗死灶最大徑和有無高血壓、高血脂患者的比較中差異有統計學意義(均P<0.05)，而在不同性別、年齡、有無吸煙和飲酒史的比較中差異無統計學意義(均P>0.05)。

表3 不同臨床特征中miR-34b和CXCL12表達的差異

2.5 miR-34b、CXCL12表達與GOS評分相關性 見圖2。為進一步研究miR-34b和CXCL12的表達與預后的相關性，利用GOS評分作為急性腦梗死患者發病后30 d的短期預后判斷指標。其中1分8例，2分23例，3分32例，4分15例，5分8例。相關回歸分析顯示miR-34b與GOS評分具有正相關性(Y=2.059X+0.7179，P<0.01)，CXCL12與GOS評分具有負相關性(Y=-0.05924X+4.062，P<0.01)。

圖2 miR-34b(左)、CXCL12(右)表達與GOS評分的相關性

2.6 miR-34b與CXCL12表達的相關性 見圖3。應用相關回歸分析，顯示miR-34b和CXCL12具有負相關性(Y=-16.24X+36.74，P<0.01)。

圖3 miR-34b與CXCL12表達的相關性

3 討 論

腦梗死的形成與血管損傷和阻塞密切相關，表現為神經細胞缺血缺氧性的壞死、脂類物質聚集能力的增強，內皮下血管壁結構的改變等[9-10]。miRNA是近年關注到的與損傷及缺血相關的因子，在病變形成和進展中具有調控作用，miRNA主要作用是調控下游靶基因發揮作用，并具有轉錄水平的調節作用[11]。miRNA種類多，作用機制復雜，在細胞周期、分化、細胞增殖和凋亡、炎性進展的調控等方面均有重要作用[12]。miR-34b是在神經細胞損傷中關注度較高的因子，劉曉蓓等[7]發現miR-34b可以調控Keap1減弱神經細胞損傷后的氧化應激反應。CXCL12是應用生信分析發現的與miR-34b有結合位點的因子之一，其可能作為miR-34b的下游因子之一，與腦梗死形成相關。CXCL12為炎性損傷形成過程中調節相關的重要因子[13-14]，其基因均定位于4q21上，是結構上具有與家族中其他成員具有同源性的小分子的分泌蛋白，不僅能被干擾素誘導產生并活化，還能定向趨化并活化T細胞，促進炎性進展時的免疫性損傷[15]。研究認為CXCL12與受體結合后，能有效激活CD4陽性的T細胞、組織細胞及NK細胞，加速腦梗死形成后神經細胞的損傷，并形成局灶區的炎性反應[16]。

本研究結果顯示急性腦梗死患者血清中miR-34b的表達明顯下調，CXCL12的表達明顯上調，兩者在不同梗死灶最大徑和有無高血壓、高血脂患者的比較中差異有統計學意義，提示miR-34b下調和CXCL12上調均參與急性腦梗死病變的形成和進展。miR-34b表達下調時對神經細胞的微環境有明顯影響，尤其是缺氧后神經細胞的應激性損傷[17]，此途徑可能與對CXCL12的調節作用有關。粥樣硬化是血管損傷及阻塞的重要原因，其機制與巨噬細胞形成及聚集、炎性反應等有關，miR-34b和CXCL12可能均參與機體損傷神經細胞周圍巨噬細胞聚集效應，促進機體局部炎性反應[18]。miR-34b下調可能是巨噬細胞的活化及平滑肌細胞反應性增生的誘導因子，參與到脂質代謝過程[19]。但是相關研究均顯示CXCR2、CXCR4和CXCL12等的作用過程相似，這種調控可能還涉及ERK、MAPK、AMPK和NF-κB等更多的橋聯因子，共同調節神經細胞的損傷、修復及微環境的改變等[20]。也有研究顯示miRNA可通過調控腫瘤壞死因子的釋放，改善血管內皮細胞的黏附作用，使平滑肌細胞的修復功能增加，當其表達下調后修復功能下降，加重神經細胞的損傷[21]。CXCL12與受體CXCR3結合的敏感性和程度較高，能高效誘導炎性相關細胞聚集并釋放相關遞質，如腫瘤壞死因子-α、白介素-6(IL-6)等，促進炎性損傷后細胞增殖的功能。本研究結果顯示miR-34b的下調、CXCL12上調均對急性腦梗死診斷具有預測價值，提示兩指標的改變在病變早期診斷中有重要價值，本研究結果更傾向于CXCL12的預測效果更理想。miR-34b和CXCL12均與發病后30 d時的GOS評分具有相關性，即miR-34b下調、CXCL12上調的患者預后較差，提示早期檢測miR-34b和CXCL12的表達對患者早期進行預后評估有一定意義。雖然本研究發現了miR-34b和CXCL12具有診斷及預后評估價值，但是后續實驗應擴大樣本進行多中心的實驗進一步驗證，并確定其臨界值。

總之，急性腦梗死患者血清中miR-34b的表達下調、CXCL12的表達上調，兩者具有負相關性，對病變形成和進展有一定促進作用，早期檢測miR-34b和CXCL12對判斷預后有一定價值。