腹瀉驢駒糞源大腸桿菌的分離鑒定及毒力與耐藥性分析

劉璐瑤，肖海俠，茍忻月，張毅，艾柯代·吐魯洪，鄭佳玉，程雪梅，郭慶勇，佟盼盼，蘇戰(zhàn)強(qiáng)

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

我國(guó)是傳統(tǒng)養(yǎng)驢大國(guó)，隨著驢役用地位的降低，新疆驢的存欄數(shù)已由2013年的90.3萬頭急劇下降到2018年的14.8萬頭，6年間存欄數(shù)量累計(jì)下降83.6%［1］。腹瀉是引起驢駒死亡的常見病因之一［2］。0～6月齡驢駒腹瀉發(fā)生現(xiàn)象較普遍，其中大腸桿菌是引起驢駒腹瀉的主要致病菌之一，以體溫升高、劇烈腹瀉、脫水、嚴(yán)重時(shí)引發(fā)敗血癥為主要臨床癥狀［3］，導(dǎo)致驢駒生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、生產(chǎn)性能降低，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

驢駒腹瀉的發(fā)病率和病死率在不斷升高，給驢駒疾病的臨床治療帶來了極大困難［4］。2020年，新疆和田地區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)驢場(chǎng)爆發(fā)了驢駒腹瀉病，本試驗(yàn)旨在探究引起驢駒腹瀉的病原及其臨床耐藥情況，從而為其生產(chǎn)管理和疾病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料采集 2020年5月，無菌采集新疆和田某驢場(chǎng)腹瀉驢駒的糞便樣本，低溫保存，及時(shí)進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分析。

1.1.2 主要試劑及儀器 主要試劑：腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）、Mueller-Hinton瓊脂（以下簡(jiǎn)稱MH）、麥康凱培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱MH），購自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌微量生化鑒定管，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；PCR反應(yīng)相關(guān)試劑（2×TaqPCR Green Mix、ddH2O），購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

主要儀器：自動(dòng)高壓滅菌器（HVE-50）、離心機(jī)（Eppendorf AG 22331 Hamburg）、振蕩培養(yǎng)箱（ST-F160AC）、SW-CJ-2F雙人超凈臺(tái)，購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TProfessional PCR儀，購自Biometra公司；凝膠成像系統(tǒng)，購自UniversalHoodll BioRad公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明系小白鼠，18～25 g/只，購自新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大腸桿菌的分離與培養(yǎng) 將腹瀉樣本接種于BHI培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。使用接種環(huán)蘸取菌液接種于麥康凱培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，挑取不同形態(tài)、大小、顏色的單個(gè)菌落，革蘭氏染色鏡檢；隨后分別接種于麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，革蘭氏染色鏡檢。純化3～4代后，使用50%甘油保菌，并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 16S rDNA鑒定 提取純化后的菌株DNA，用16SrDNA引物進(jìn)行擴(kuò)增［5］（表1）。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳液中電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物送至鼎國(guó)生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，所得序列在BLAST上進(jìn)行同源性比對(duì)。

表1 引物序列

1.2.3 生化鑒定 將純化后菌株接種于微量生化鑒定管中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［5］進(jìn)行結(jié)果比較。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 選取24種常用臨床抗菌藥物，采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法進(jìn)行。用MH液體培養(yǎng)基稀釋菌液到0.5麥?zhǔn)蠞岫龋脺缇奘米诱喝【壕鶆蛲坎荚贛H培養(yǎng)基表面，靜置3～5 min后用鑷子夾取藥敏片放置在培養(yǎng)基上，靜置15 min后于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h。大腸桿菌ATCC 25922作質(zhì)控菌株，藥敏結(jié)果根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）制定的標(biāo)準(zhǔn)判定［6］。

1.2.5 耐藥基因和毒力基因檢測(cè) 根據(jù)相關(guān)報(bào)道［7-14］引物序列（表1），合成β-內(nèi)酰胺類藥物的耐 藥 基 因（blaCTX-M、blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaCTX-M-9、blaTEM和blaSHV）、四環(huán)素類藥物的耐藥基因（tetA、tetG和tetE）、氨基糖苷類藥物的耐藥基因（aac和aadA1）、磺胺類藥物的耐藥基因（sul1）和氯霉素類的耐藥基因（cmlA）。根據(jù)參考文獻(xiàn)［15-20］中報(bào)道的引物序列（表1），合成毒力基因astA、sepA、escV、hlyA、fyuA、ler、irp2、iucD和eaeA。PCR擴(kuò)增體系（25μL）：2×TaqPCR Green Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至25μL。擴(kuò)增后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.6 致病性試驗(yàn) 將分離菌株接種于BHI培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)18～24 h；用BHI將菌液稀釋至1×108cfu/mL。取昆明小白鼠40只，每5只為一組，隨機(jī)分為8組，禁食不禁水12 h后，試驗(yàn)組腹腔注射菌液0.3 mL/只（A～C組），對(duì)照組小鼠注射等量生理鹽水，觀察小鼠在72 h內(nèi)精神狀態(tài)、食欲、發(fā)病和死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離與鑒定

將采集的3份腹瀉驢駒的糞便樣本接種于麥康凱培養(yǎng)基上，共篩選出3株菌，在平板上形態(tài)均為紅色、中等大小、表面光滑、邊緣整齊的桃紅色菌落。鏡檢結(jié)果顯示，分離菌均呈現(xiàn)單個(gè)、著色均勻以及紫紅色兩端鈍圓、無芽孢、無莢膜短桿菌，為革蘭氏陰性菌。經(jīng)生化鑒定顯示，硫化氫、苯丙氨酸與尿素為陰性，蛋白胨水（靛基質(zhì)）呈陽性，均能發(fā)酵葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、乳糖與衛(wèi)矛醇，在西蒙氏枸櫞酸鹽上有個(gè)別菌株為陽性，所有生化反應(yīng)完全符合大腸桿菌的特性。對(duì)所得菌株進(jìn)行16SrDNA PCR檢測(cè)，在1500 bp處出現(xiàn)清晰明亮的目的條帶（圖1），將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，結(jié)合分離菌株在平板生長(zhǎng)特點(diǎn)以及生化鑒定結(jié)果，最終確定3株分離菌為大腸桿菌。

圖1 16SrDNA PCR擴(kuò)增圖譜

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，3株大腸桿菌均對(duì)頭孢噻吩、頭孢唑林、氨芐西林、哌拉西林、苯唑西林、青霉素G、四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素和氟苯尼考表現(xiàn)出100%耐藥，僅對(duì)頭孢吡肟、頭孢西丁表現(xiàn)為高度敏感。

表2 3株大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)菌株的耐藥組合進(jìn)行歸類，3株大腸桿菌分別對(duì)16、18、19種抗生素耐藥（圖2），提示此驢場(chǎng)的抗菌藥物使用不規(guī)范，抗菌藥物過度使用。

圖2 大腸桿菌分離株對(duì)24種藥物的耐藥組合情況

2.3 耐藥基因的PCR檢測(cè)

對(duì)3株驢駒糞源大腸桿菌進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，結(jié)果（圖3）表明，13種耐藥基因共檢測(cè)出7種，分別為blaCTX-M-1（100%）、blaTEM（100%）、tetG（100%）、blaSHV（100%）、aadA1（66.7%）、sul1（66.7%）和cmlA（66.7%），未檢測(cè)出blaCTX-M、blaCTX-M-2、blaCTX-M-9、tetA、tetE和aac基因。

圖3 耐藥基因擴(kuò)增圖譜

2.4 大腸桿菌毒力基因的PCR檢測(cè)

由圖4可知，9種毒力基因共檢出fyuA（66.7%）、irp2（100%）、iucD（100%）3種，目的條帶大小分別為953、413、714 bp；其他基因均未檢測(cè)出。

圖4 毒力基因擴(kuò)增圖譜

2.5 致病性試驗(yàn)結(jié)果

將純化后的菌液分別腹腔注射小鼠后，試驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、扎堆、飲食欲下降、被毛粗亂、尿液顏色發(fā)黃等現(xiàn)象。A組和B組均死亡4只，C組死亡3只，對(duì)照組無小鼠死亡現(xiàn)象；對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，可見胃腸道內(nèi)充盈黃色膿性液體且腸壁變薄、部分腸管出現(xiàn)臌氣、肝臟出血、脾臟邊緣暗紫色。無菌采集死亡小鼠肝臟等病料，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，形態(tài)顏色等與大腸桿菌一致，表明從腹瀉驢駒糞便中分離的大腸桿菌均為致病性大腸桿菌。

3 討論與結(jié)論

驢養(yǎng)殖業(yè)是中央發(fā)布的精準(zhǔn)脫貧的新興特色產(chǎn)業(yè)，由于自然環(huán)境和地域經(jīng)濟(jì)等狀況的約束，發(fā)病率和死亡率逐年增長(zhǎng)，其中驢駒腹瀉病嚴(yán)重者可引起驢駒脫水死亡。引起驢駒腹瀉的原因是多因素的。有研究者證明輪狀病毒與霉菌均可引起此癥狀，同時(shí)消化不良也可能會(huì)引起驢駒腹瀉［21］；由大腸桿菌導(dǎo)致的幼駒腹瀉病死亡率為10%～20%［22］。

大腸桿菌是重要的條件致病菌，一般通過糞便的排出從而污染圈舍、飼料、水槽及飲水、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)地，是驢養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)重大隱患［23］。有研究證實(shí)大腸桿菌可依靠其快速定殖能力迅速侵襲新生幼駒胃腸道系統(tǒng)，表現(xiàn)為持續(xù)性劇烈腹瀉，嚴(yán)重者表現(xiàn)為出血性腸炎，長(zhǎng)期腹瀉易導(dǎo)致機(jī)體脫水、電解質(zhì)紊亂及敗血癥［24］。本試驗(yàn)從分離出的3株大腸桿菌中共檢出3種毒力基因，分別為fyuA（66.7%）、irp2（100%）、iucD（100%）基因，其中fyuA和irp2的檢出率與黑龍江地區(qū)［25］的差異較大。iucD的檢出率遠(yuǎn)高于山東地區(qū)［26］（57%），說明大腸桿菌攜帶的毒力因子分布可能存在地域性差異。小鼠攻毒試驗(yàn)表明，所有分離株均具有致病性，表明新疆部分地區(qū)驢源大腸桿菌的致病性較強(qiáng)。

大腸桿菌的耐藥性隨著人們對(duì)抗生素的過度使用呈線性增長(zhǎng)，出現(xiàn)了多重耐藥和交叉耐藥的現(xiàn)象，使臨床治療效果越來越差［27］。新疆石河子、沙灣等地區(qū)［28］導(dǎo)致犢牛腹瀉的大腸桿菌對(duì)頭孢西丁、阿米卡星具有較高敏感性，本試驗(yàn)中分離株對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、米諾環(huán)素、妥布霉素和阿米卡星的敏感性較高，說明同一地區(qū)、不同動(dòng)物的糞源大腸桿菌的耐藥較一致。山西省某驢場(chǎng)大腸桿菌僅對(duì)青霉素G和多黏菌素B耐藥［29］，本試驗(yàn)分離株對(duì)頭孢噻吩、頭孢唑林、氨芐西林、哌拉西林、苯唑西林、青霉素G、四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素和氟苯尼考共13種臨床常用抗生素高度耐藥，其中1株分離菌對(duì)19種抗生素耐藥，說明該驢場(chǎng)大腸桿菌的耐藥性極強(qiáng)，抗菌藥物的不合理使用導(dǎo)致大腸桿菌選擇性地對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥性［30］。

通過對(duì)3株驢駒腹瀉糞源大腸桿菌進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，該驢場(chǎng)的耐藥基因攜帶情況與耐藥表型基本一致。3株大腸桿菌的β-內(nèi)酰胺類藥物基因（blaCTX-M-1、blaTEM、blaSHV）攜 帶 率 均 為100%，與在廣西地區(qū)［31］的檢出率一致。四環(huán)素類藥物耐藥基因tetG的檢出率高達(dá)100%，與在江西地區(qū)［32］檢測(cè)結(jié)果一致。氨基糖苷類藥物基因（aadA1）、磺胺類藥物基因（sul1）和氯霉素類基因（cmlA）的攜帶率為66.7%，河北地區(qū)［33］、貴州地區(qū)［34］和四川地區(qū)［32］的基因檢出率高于本研究。由此推測(cè)，攜帶耐藥基因可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，臨床上在對(duì)驢駒腹瀉病進(jìn)行治療時(shí)，需嚴(yán)格控制抗菌藥物使用，先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇敏感性較高的抗菌藥物，合理用藥，防止出現(xiàn)廣譜耐藥的“超級(jí)細(xì)菌”［35］。