肝纖維化相關信號通路及其相應的抗肝纖維化藥物研究進展

魯蘇日古嘎， 劉 霆， 朱單單， 余思佳， 盧禮卿， 丁俊杰

中南大學湘雅醫院， 長沙 410000

肝纖維化由于其患病率迅速增加以及缺乏具體有效的治療方法而成為世界范圍內的主要健康問題。如未行有效的治療干預，隨著病情的發展肝纖維化將形成肝纖維結節，破壞正常的肝臟結構與功能，最終發展為肝硬化，導致肝功能的衰退，甚至進展為肝癌。肝星狀細胞(HSC)的激活和轉分化是肝纖維化的中心環節，是各類肝損傷導致肝纖維化的共同通路[1]。正常情況下, HSC處于靜止表型狀態，富含維生素A脂滴。在各種類型的肝損傷刺激下，HSC分化為肌成纖維細胞，并獲得典型的“肌成纖維樣細胞”表型：以細胞內脂滴減少或消失、粗面內質網增加、高爾基體發達、表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、合成大量細胞外基質(ECM)成分(包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原蛋白、纖連蛋白、層黏連蛋白)為特征[2]。目前普遍認為肝纖維化是可逆的，潛在治療方法有：從最基礎的去除刺激性肝損傷因素到抑制或調節肝臟炎癥、護肝作用、下調HSC的活化(增殖、纖維形成和/或收縮)、促進基質降解、促進HSC特異性凋亡等。其中以下調HSC的活化(增殖、纖維形成和/或收縮)和促進基質降解為主，主要信號傳導通路有TGFβ/SMAD、JAK-STAT通路等(詳見附錄1)。

1 肝纖維化相關信號通路及其拮抗劑

1.1 TGFβ/SMAD信號通路及其拮抗劑 TGFβ信號通路是促進HSC活化和誘導ECM生成的關鍵信號通路。當肝臟受到損傷因子刺激時，TGFβ通過結合TGFβⅡ型受體(TβRⅡ)開始信號傳導，募集TGFβⅠ型受體(TβRⅠ)，隨后后者發生構象改變，使下游SMAD2和SMAD3蛋白持續磷酸化為pSMAD2和pSMAD3后與SMAD4形成復合物易位到細胞核結合DNA，調節多個靶基因如αSMA、CTGF的轉錄，最終使HSC活化，并誘導Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成，而SMAD7則抑制該通路[3]。最近的研究[4]表明，PZQ通過上調 Smad7抑制TGFβ/Smad信號通路減輕 CCl4誘導的小鼠肝纖維化。羅格列酮可通過抑制TGFβ1的表達和 Smad2/3的磷酸化，抑制 HSC 活化，減輕肝纖維化和炎癥反應，同時減輕肝脂質積累和過氧化應激[5]。Lenvatinib是一種分子靶向藥，可通過抑制Smad2/3途徑，減少Ⅰ型膠原、TGFβ1的表達來抑制肝纖維化[6]。此外，中藥下瘀血湯對TGFβ超家族成員GDNF誘導的HSC活化具有抑制作用[7]。

1.2 JAK-STAT通路及其拮抗劑 STAT是一類具有信號轉導功能又有轉錄活化功能的胞漿蛋白，通過與JAK 信號偶聯，與靶基因DNA結合，調控轉錄。現已發現7個STAT家族成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。在HSC中，STAT1激活可限制HSC的增殖和纖維化活性，而STAT3激活可促進肝纖維化的發生，如IL-6通過激活JAK2/STAT3，被激活的STAT蛋白以二聚體的形式轉到細胞核與靶基因結合并調節基因轉錄調控是經典的HSC激活通路。

STX-0119是一種新型STAT3抑制劑，通過IL-6介導的STAT3通路滅活HSC的活化來減輕肝纖維化[8]。蘆可替尼(ruxolitinib)是一種新型JAK1和JAK2靶向藥物，臨床上主要應用于抑制骨髓纖維化。有研究[9]表明，蘆可替尼可通過降低磷酸化酪氨酸蛋白激酶-1/2(p-JAK1/2)、磷酸化信號轉導激活轉錄因子-3(p-STAT3)蛋白表達來靶向抑制HSC中JAK1/2-STAT3通路激活，進而降低HSC活化程度,抑制HSC增殖,減少ECM合成能力。索拉非尼可通過直接抑制HSC中的STAT3和抑制Kupffer細胞釋放IL-6激活肝細胞中的STAT3這兩種方式改善肝纖維化[10-11]。利匹韋林可通過激活STAT1，選擇性的誘導HSC凋亡，通過激活STAT3促進肝細胞增殖，表現出明顯的抗炎和抗纖維化作用[12]。

1.3 Wnt/β-catenin信號通路及其拮抗劑 Wnt/β-catenin 信號通路的異常表達，不僅涉及肝腫瘤的發生和發展，而且還參與了肝細胞增殖、HSC激活、肝纖維化、肝硬化、肝局灶性結節性增生等肝病病理生理的多個過程[13]。當跨膜受體Fzd蛋白家族接收信號后，可通過下游蛋白激酶的磷酸化作用抑制GSK3β等蛋白形成的β-Catenin降解復合物的降解活性，使胞漿中積累的β-Catenin進入細胞核后結合TCF/LEF轉錄因子家族，啟動下游靶基因的轉錄。多梳抑制復合物(protein regulator of cytokinesis 1，PRC1)可通過調節 Wnt/β-catenin 介導的 GLI1-依賴性骨橋蛋白表達而加重肝纖維化，敲除PRC1可抑制活化的HSC的細胞活性，促進HSC凋亡[14]。人骨髓間充質干細胞來源的外泌體(hBM-MSCs-Ex)可通過抑制 Wnt/β-catenin通路，降低α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的表達，減輕肝纖維化，包括減少膠原積累，抑制炎癥反應，增加肝細胞再生[15]。蛋白質RSPO是Wnt/β-catenin信號轉導增強子，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者體內升高，使用抗RSPO3抗體OMP-131R10在治療性劑量下可減輕CCl4誘導的肝纖維化[16]。

1.4 Notch信號通路及其抑制劑 Notch信號通路是肝臟病理生理的重要參與者，促進肝細胞祖細胞向膽管細胞的分化。Notch配體結合并誘導γ-分泌酶介導的Notch受體裂解，釋放Notch細胞內結構域(NICD)，NICD易位到細胞核中，與其Notch效應器結合，促進肝纖維化。γ-分泌酶復合物的小分子抑制劑，可防止Notch受體的激活裂解，降低肝臟 Notch 活性，改善葡萄糖代謝，并改善NASH飲食誘導的肝纖維化，但同時可能引起與腸道Notch抑制相關的杯狀細胞化生[17]。一種納米粒子介導的靶向肝臟γ-分泌酶抑制劑(GSI NP)可減少Notch靶基因表達，同時顯著減少炎癥和纖維化基因表達，且無胃腸副作用[18]。Niclosamide為Notch抑制劑，在膽管結扎(BDL)誘導的小鼠膽汁淤積性肝纖維化(cholestatic liver fibrosis,CLF)實驗模型中，可顯著減少Notch通路成分(Jagged1、Notch2、Notch3、HES1)，同時降低α-SMA和膠原沉積[19]。在NASH小鼠模型中，肝細胞Notch的激活增加肝細胞中Sox9依賴性骨橋蛋白的表達和分泌以激活HSC，從而誘導小鼠的肝纖維化，而使用Notch抑制劑(反義寡核苷酸Ncst ASO)可抑制小鼠的肝纖維化[17]。

1.5 Hedgehog 信號通路及其抑制劑 Hedgehog信號通路又稱為Hh-Ptch/Smo-Gli 調節軸。凋亡的肝細胞產生Hh配體，Hh配體及其受體平滑同源物(SMO)促進HSC激活。Hh配體與Ptch結合后可使Ptch對SMO的抑制作用解除，解除抑制的SMO可在細胞核中誘導轉錄因子Gli家族的激活。HSC活化時，胞內有Shh配體表達，可激活Shh信號通路促使HSC增殖[20]。藍藻細菌分泌的微胱氨酸-亮氨酸-精氨酸(MC-LR)通過調節HSC中Hedgehog信號通路中的轉錄因子Gli2的表達而誘導肝纖維化[21]。PB2可通過抑制HIF-1a來抑制Hedgehog信號通路降低SMO和Gli1表達發揮抗肝纖維化作用且對肝功能和肝臟病理無毒性作用[22]。Gant61，一種Gli1/2轉錄因子抑制劑，可通過抑制Hedgehog通路使HSC細胞周期阻滯，肝纖維化程度降低[23]。

2 抗肝纖維化相關受體及其激動劑/配體

2.1 法尼醇X受體(FXR)及其激動劑/配體 FXR是一種在肝臟和腸道中高水平表達的核激素受體，膽汁酸是FXR的內源性配體，因此FXR又稱膽汁酸受體。肝內FXR轉錄激活后誘導小異二聚體配體(small heterodimer partner，SHP)基因表達后與SHP結合，通過抑制CYP7A1基因表達來抑制膽汁酸的合成，在動物模型中顯示出明顯的抗炎和抗纖維化作用[24]。肝內FXR配體通過上調HSC中的SHP，可減少60%～70%膠原蛋白Ⅰ和TGFβ1，并抑制凝血酶和TGFβ1誘導的膠原蛋白Ⅰ mRNA的上調，從而顯著降低膠原蛋白Ⅰ水平[24]。一種FXR激動劑6-ECDCA可通過促進FXR和SHP的激活，抑制金屬蛋白酶組織抑制劑的表達，增加MMP-2的表達，促進ECM的溶解[25]。奧貝膽酸(obeticholic acid,OCA)屬于半合成的鵝去氧膽酸(最活躍的內源性配體)，一項多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照研究Ⅲ期臨床試驗[26]結果顯示，相比于安慰劑，每日服用25 mg OCA可顯著改善NASH患者的肝纖維化及部分反應NASH活動度的關鍵指標。

2.2 過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR)γ與及其激動劑/配體 PPAR是一組配體依賴性核轉錄因子，通過調節下游靶向通路，如TGFβ、MAPK和NF-κB等，在各種器官尤其是肝臟的纖維化中發揮重要作用。PPAR包含PPARα、 PPARβ/δ 和 PPARγ 3種亞型，其中PPARγ與肝纖維化關系最為密切。PPARγ與配體結合后被激活，并與視黃酸 x 受體結合形成異二聚體與靶基因啟動子的過氧化物酶體增殖物反應元件結合，可抑制HSC活化、增殖和ECM的產生[27]。PPARγ從激活的表達狀態恢復后可將肝肌成纖維細胞逆轉為靜止狀態的HSC。如有研究者[28]通過腺病毒載體在活化的大鼠HSC的原代培養物中表達了Dkk-1蛋白后發現，Dkk-1蛋白可通過恢復PPARγ基因的表達誘導大多數Dkk-1轉導的細胞中活化HSC逆轉為靜止表型[28]。PPARα/γ激動劑saroglitazar改善飲食誘導非酒精性脂肪性肝病動物模型的胰島素抵抗和脂肪性肝炎[29]。Marra等[30]應用PPARγ激動劑抗糖尿病藥物噻唑烷二酮可減少慢性膽汁淤積模型中的膽管增生和纖維化，Ⅰ型前膠原基因表達下降。

注：多種細胞信號傳導通路構成復雜的網絡，共同參與了肝纖維化的發生和發展。細胞膜上受體接受信號刺激后，通過其信號通路下游靶點傳達信號，最終在細胞核調節多個肝纖維化相關靶基因的表達。miRNA等非編碼RNA也參與這些信號傳導，或促進或抑制肝纖維化。Col1a1：表達Ⅰ型膠原蛋白；Col3a1：表達Ⅲ型膠原蛋白。

3 非編碼RNA

非編碼RNA是指不編碼蛋白質的RNA。其中包括長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)、小核RNA(small nuclearRNA,snRNA)、小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)等多種已知功能的 RNA，還包括未知功能的RNA。這些RNA的共同特點是都能從基因組轉錄而來，但不翻譯成蛋白，在RNA水平上發揮各自的生物學功能。其中miRNA和lncRNA在肝纖維化方面研究較為深入，涉及調控HSC的活化、增殖，介導HSC凋亡及自噬等。多種非編碼RNA直接或間接影響 HSC特異性細胞信號傳導，參與肝纖維化進程，有些非編碼RNA參與 HSC 激活并發揮明確的促纖維化作用，也有的則相反，具有抗肝纖維化作用(圖1)。同一個非編碼RNA在不同類型細胞中表達不同，如在肝纖維化進展過程中，miR-150-5p 在肝細胞和HSC中受到不同的調節：在肝細胞中上調，在HSC中下調[31]。同一個非編碼RNA可作用于不同靶標，不同的非編碼RNA也會共同促進或抑制同一個靶標，這些非編碼RNA形成一個復雜的網絡體系。在這個網絡體系中，miRNA通過沉默誘導復合體抑制基因表達，而lncRNA除直接調控信號通路上相關基因、蛋白的表達外，和circRNA一樣可以作為內源競爭RNA與miRNA競爭其結合位點，調節靶基因的表達。

4 小結

肝纖維化信號通路錯綜復雜，除了上述各種途徑，還有諸多其他信號通路參與。不但這些信號通路之間存在“串話” (Cross talk) 作用，器官之間也有串擾作用，如肝-腎軸，腸-肝軸等。而不斷的發現新的途徑和介體，包括自噬、內質網應激、表觀遺傳學、非編碼RNA、外泌體等均體現了肝纖維化過程的復雜性。上文中提到的干預環節和靶標研究大多處于前瞻性研究階段，有些已進入臨床階段，但是在晚期纖維化難以治療的情況下，迫切需要探索新的可行性方案以改善肝纖維化的治療現狀。筆者認為臨床上理想的抗肝纖維化藥物應滿足以下條件：肝特異性；長期使用可耐受，全身副作用可控；能有效減少過多的膠原沉積而不影響正常的細胞外間質合成。治療期望并非一定要徹底逆轉肝纖維化，而是減緩其進展，以使慢性肝病患者免于因纖維化導致的終末器官衰竭(例如門靜脈高壓、腹水和肝衰竭)而死亡。相信隨著對這些信號通路及其調節劑的深入闡明，必將為肝纖維化的發生機制提供新的認知，繼而研發安全有效，可用于控制、防治，甚至是逆轉肝纖維化的有效藥物。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：魯蘇日古嘎負責資料收集及文章撰寫；朱單單、劉霆、盧禮卿、余思佳、丁俊杰參與修改文章內容。

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