涼味劑對電子煙氣溶膠吸入小鼠模型的成癮性作用研究*

徐智彬，齊旭剛，莫之準，湯佳航，吳澤宏，許靜，姜興濤，路中華，劉欣安**

（1.廣東省腦連接圖譜重點實驗室，中國科學院腦聯結解析與調控重點實驗室，深港腦科學創新研究院，中國科學院深圳先進技術研究院腦認知與腦疾病研究所，廣東 深圳 518055；中國科學院大學，北京 100049；2.深圳霧芯科技有限公司科學中心，廣東 深圳 518101）

吸煙是全球最大的公共衛生威脅之一，中國吸煙人數全球排名第一，因此控制吸煙成癮刻不容緩。更安全的尼古丁產品如電子煙為消耗尼古丁提供了一種不可燃的方式，為傳統煙草替代提供一種可能性。尼古丁是世界上排名第一的成癮性物質之一，全世界大多數用戶（約68%）通過吸煙來消耗尼古丁。尼古丁俗稱煙堿，是香煙的主要化學成分及主要致癮成分，也是目前電子煙產品的主要成分。尼古丁作用于大腦神經系統[1]，令人產生依賴性[2]和戒斷困難[3]。尼古丁主要通過結合大腦中的尼古丁乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）而起作用。目前市場上電子煙的口味多達8 000種，對于含有不同口味添加劑的電子煙產品的安全性及神經效應都有待進一步深入研究。其中市場上運用最廣泛的口味添加劑之一是涼味劑WS-23［化學名稱為N，2，3-三甲基-2-（1-甲基乙基）丁酰胺或者N，2，3-三甲基-2-異丙基丁酰胺；N，2，3-trimethyl-2-isopropl butanamide］。由 于WS-23可賦予產品清涼的口感，廣泛用于食品、飲料、糖果、化妝品、煙制品及醫藥等領域。涼味劑WS-23作為霧化液氣溶膠吸入毒性的研究已有相關報道[4]，同時電子煙作為具有潛在成癮性的產品，霧化液中的涼味添加劑本身及其與尼古丁混合霧化后形成的氣溶膠吸入對成癮性等精神行為的影響有待深入研究。本項目旨在小鼠動物模型上運用精準的氣溶膠霧化給藥系統建立長期暴露模型，用于評估不同霧化液成分及其與尼古丁混合后的氣溶膠吸入對不同實驗動物模型的成癮性行為，本文特異性地探討電子煙霧化液中的涼味添加劑WS-23是否對小鼠的氣溶膠長期暴露所產生的成癮性有影響，并為未來的神經精神性機制探討提供可靠的動物研究模型和評估手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與生物材料

本課題實驗動物SPF級C57BL/6J雄性小鼠，8周齡，由北京維通利華實驗動物技術有限公司購入。實驗動物于經過國家認證的SPF級動物飼養間屏障環境內飼養，屏障內溫度與相對濕度范圍分別是20～26 ℃、40%～70%，采用12 h∶12 h晝夜間斷照明，保證充足的飼料與水自由飲食，本研究方案經過中國科學院深圳先進技術研究院實驗動物倫理委員會審議通過，符合實驗動物福利倫理規范要求。實驗動物倫理審查受理號：SIATIACUC-190221-NS-LXA-A0610。所有小鼠組織取材工作均在經注射氯胺酮（Ketamine，100 mg/kg）和甲苯噻嗪（xylazine，10 mg/kg）麻醉并斷頸處死后進行。按照實驗需求將小鼠隨機分組，共32只，分為4組，每組8只，分組如下：A組：溶劑對照組（Vehicle）；B組：純WS-23組（WS-23）；C組：純尼古丁組（Nicotine）；D組：WS-23+尼古丁組（WS-23+Nicotine）。

1.2 試劑與溶液制備

WS-23（N-2，3-三 甲 基-2-異 丙 基 丁 酰胺，CAS No. 51115-67-4）采購于昆山亞香香料股份有限公司（純度≥99.9%），載體溶劑甘油（vegetable glycerin，VG）和 丙 二 醇（propylene glycol，PG）分別采購于陶氏化學和寶潔公司，尼古丁采購于湖北和諾生物工程股份有限公司（純度≥99.5%）。

本實驗中各氣溶膠霧化液的配方如下：空白溶劑對照組電子霧化液的配制：50%PG+50%VG；WS-23組電子霧化液的配制：5%WS-23+45%PG+50%VG；Nicotine組電子霧化液的配制：4%Nicotine+46%PG+50%VG；WS-23+Nicotine組電子霧化液的配制：5%WS-23+4%Nicotine+41%PG+50%VG。

1.3 儀器與暴露程序

InExpose全身煙霧暴露系統：InExpose是一個高度集成的、結構緊湊的、計算機程序控制的吸入暴露系統。有全身性和僅鼻式兩種暴露形式，可實現各種氣溶膠、毒氣和煙霧的吸入暴露。配備有全自動（24支煙）的香煙煙霧發生器和電子煙發生器。體積小，內部容積少，減少研究材料的損耗。可實現4種不同的氣體的混合暴露。InExpose全身煙霧暴露系統可全面模擬電子煙暴露，精準定量煙霧中尼古丁等化學物質的含量，同時全身暴露系統避免了口鼻暴露對動物造成的束縛應激，對于煙霧暴露物質成癮[5]及精神行為的監測的干擾較小[6]（圖1）。試驗中所用電子霧化器為RELX四代無限電子霧化器（深圳霧芯科技有限公司）。

圖1 InExpose全身煙霧暴露系統示意圖

將每組每只小鼠放置于SCIREQ全身暴露系統獨立卡槽中，按照FlexiWare程序（IX-2PD-4DIOECIG inExpose，表1）固定時間段每天1次，暴露于相應電子霧化液的氣溶膠中30 min/次，流速控制在2 L/min，電子煙霧化液由深圳霧芯科技有限公司提供。氣溶膠暴露給藥連續不間斷4周，隨后進行行為學測試。

表1 FlexiWare程序參數（IX-2PD-4DIO-ECIG inExpose）

1.4 方法

1.4.1 條件性位置偏好實驗

條件性位置偏好實驗（Conditioned Place Preference，CPP）基于經典（巴甫洛夫）條件反射原理[7]，操作條件要求簡單，通常用于衡量濫用藥物的獎勵效果[8]。本實驗所用條件偏好箱由隔板分成兩個箱體，箱體各自的貼紙不同。電子煙暴露造模三周后分析小鼠在條件偏好箱中的本底偏好，重復2天取平均值。之后開始做CPP條件匹配建立，到第5天進行測試。讓小鼠自由活動15分鐘并進行錄像，分析并計算小鼠在A箱體和B箱體停留時間。條件偏好性評分=伴藥盒（A 或B）停留的時間/（A + B 盒的停留時間）。

1.4.2 高架十字迷宮實驗

高架十字迷宮實驗（Elevated plus maze test，EPM）用于測試長期氣溶膠暴露小鼠在48小時戒斷狀態下的焦慮水平[9]，在第4周造模結束后開始高架十字迷宮實驗，錄像記錄小鼠在迷宮內活動軌跡，視頻共記錄10分鐘[10]。

1.4.3 小鼠血液樣本采集

小鼠麻醉后從眼眶靜脈竇采血；血液靜置半小時后，于4 ℃離心機內以2 000 rpm離心15分鐘獲得的上清液即血清。

1.4.4 慢性氣溶膠暴露模型小鼠血清皮質酮水平測定實驗

本實驗采用小鼠皮質酮（Corticosterone）酶聯吸附測定試劑盒，該試劑盒采用競爭法酶聯免疫吸附檢測技術（ELISA）測定小鼠血清樣品中的皮質酮水平。實驗動物在戒斷后，采血經酶聯免疫檢測皮質酮含量，數據采用GraphPad Prism 9.0軟件制圖分析結果。

1.4.5 行為學數據統計與分析

行為學視頻采用ANYmaze軟件分析得出量化指標，統計采用GraphPad Prism 9.0軟件分析并制圖，數據以Mean±SEM表示，組間差異以One-way ANOVA檢驗，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2 結果

2.1 長期氣溶膠暴露小鼠模型的成癮相關行為學檢測

2.1.1 條件性位置偏好實驗

本實驗所用條件偏好箱由隔板分成兩個箱體，箱體各自的貼紙不同。實驗步驟參考經典的條件性位置偏好行為范式[11]。預測試期結果顯示，各分組實驗小鼠對兩側箱體無明顯偏好，氣溶膠暴露造模三周后開始做CPP條件匹配建立，到第5天進行測試（圖2）。在造模第3周后開始，經過一周訓練即在第4周造模結束后，條件性位置偏好（CPP）實驗測試結果顯示，跟溶劑對照組比較，純尼古丁在伴藥盒停留時間有延長，但偏愛分數差異無顯著性；純WS-23組及WS-23+尼古丁組小鼠在伴藥盒停留時間有降低，偏愛分數差異同樣沒有顯著性差異；跟溶劑對照組相比，各組間偏好分數（CPP score）未見顯著性差異；結果如圖2所示，純尼古丁組小鼠對伴藥盒內的偏愛分數與溶劑對照組比較差異無顯著性（P>0.05）；而純尼古丁組與純WS-23組及WS-23+尼古丁組相比，其偏好指數明顯增高，有顯著差異（P<0.01）。

圖2 氣溶膠暴露小鼠的條件性位置偏好測試結果

2.1.2 高架十字迷宮實驗

在第4周造模結束后，實驗小鼠停止煙霧暴露48小時后進行高架十字迷宮檢測，錄像記錄小鼠在迷宮內活動狀態。通過分析實驗動物在實驗區域（開臂與閉臂）的行動軌跡判斷小鼠的焦慮狀態。圖3中的分析結果顯示，含WS-23的氣溶膠長期暴露小鼠較不含WS-23的小鼠總體的運動距離減少（圖3A）。圖3B顯示，與溶劑對照組或純尼古丁組相比，含WS-23的氣溶膠長期暴露小鼠（包括純WS-23組及WS-23+尼古丁組）的運動速度也顯著下降。與溶劑對照組相比，純尼古丁組、純WS-23組及WS-23+尼古丁組小鼠待在開臂的時間無明顯差異（圖3C）；WS-23+尼古丁組小鼠在閉合臂的運動時間較溶劑及純尼古丁組顯著延長（圖3D）。進一步地，WS-23+尼古丁組小鼠與純尼古丁組相比在開放臂的運動距離顯著降低（圖3E），而待在開放臂的運動距離百分比無顯著差異（圖3F）；各組實驗小鼠進入開放臂的次數（圖3G）和百分比（圖3H）均無顯著差異。

圖3 氣溶膠暴露小鼠48小時戒斷后高架十字迷宮測試結果

2.2 長期氣溶膠暴露小鼠戒斷48小時的血清皮質酮含量分析

為了進一步檢測實驗小鼠的氣溶膠暴露戒斷后可能的生理反應，本研究檢測了小鼠戒斷48小時的血清皮質酮含量。在不同霧化液的長期氣溶膠暴露的各組實驗小鼠經歷48小時戒斷后，采血經酶聯免疫檢測皮質酮含量。檢測結果如圖4顯示，不含尼古丁組包括電子煙霧化液溶劑對照組和WS-23組的小鼠戒斷后血清皮質酮含量相互間不存在統計學差異；含尼古丁組和不含尼古丁組比，小鼠48小時戒斷后血清皮質酮含量都有升高，含尼古丁組包括純尼古丁組與WS-23+尼古丁組的氣溶膠長期暴露小鼠的血清皮質酮含量由于組內差異較大，不存在統計學差異。

圖4 長期氣溶膠暴露小鼠戒斷48小時血清皮質酮濃度

3 討論

3.1 霧化涼味劑WS-23對小鼠獎賞行為的作用

對電子煙氣溶膠的成癮性評估一直是個難點。尼古丁是電子煙霧化液中的主要致癮成分。除了尼古丁之外，電子煙霧化液中其他成分如PG/VG，以及常用的添加物如涼味劑WS-23等是否具有成癮性；這些口味添加劑如何影響尼古丁的成癮性的研究尚不深入。本研究通過精準的霧化氣溶膠暴露儀器InExpose構建小鼠電子煙氣溶膠長期慢性暴露模型（每天半個小時，連續4周），并采用條件位置性偏好實驗，分析和比較了氣溶膠載體溶劑PG/VG、純尼古丁、純涼味劑WS-23及涼味尼古丁氣溶膠四種不同霧化液的致成癮性。實驗結果表明，在本實驗條件即每天短時程氣溶膠暴露，即使進行為期1個月的慢性不間斷暴露，溶劑及純尼古丁氣溶膠暴露均未誘導實驗小鼠產生明顯獎賞性偏好行為，尼古丁氣溶膠長期暴露的小鼠在CPP測試中只顯示一定程度的正性獎賞性偏好，而純涼味劑以及涼味尼古丁氣溶膠暴露小鼠表現出顯著的條件位置性厭惡。本研究結果表明，在本實驗中的長期、短時程氣溶膠暴露條件下，溶劑PG/VG以及純尼古丁霧化液暴露對小鼠并不產生顯著的獎賞作用；而涼味劑WS-23氣溶膠和涼味尼古丁氣溶膠長期暴露在小鼠模型上未使得實驗小鼠產生獎賞性偏好，涼味劑WS-23 及涼味尼古丁氣溶膠暴露誘導小鼠的厭惡行為。根據最近的文獻報道，WS-23在大鼠的急性及亞急性吸入實驗中都未表現出明顯的毒性反應[4]，而本實驗結果表明實驗小鼠對WS-23不僅沒有表現出喜好，相反地，對純涼味劑和含涼味劑的霧化液都表現出場景關聯回避行為。Henderson等人曾報道薄荷醇不同異構體對乙酰膽堿受體的上調及多巴胺神經元自發放電具有顯著差異[12]，可見不同化學結構的涼味劑對于大腦獎賞系統及氣溶膠成癮性具有復雜的作用。

3.2 涼味劑WS-23對長期氣溶膠暴露小鼠的戒斷后焦慮行為的影響

高架十字迷宮實驗用于測試長期氣溶膠暴露小鼠在48小時戒斷狀態下的焦慮水平，從而間接反映小鼠對氣溶膠暴露的成癮性。在本實驗中，通過高架十字迷宮行為檢測，比較和分析了在停止氣溶膠暴露48小時后，各組小鼠的焦慮水平和運動量。結果提示，涼味尼古丁氣溶膠暴露小鼠48小時戒斷后未見明顯的焦慮樣行為；雖然純涼味劑WS-23及涼味尼古丁氣溶膠暴露小鼠的戒斷后運動距離和速度顯著下降，涼味尼古丁暴露小鼠在閉合臂停留時間顯著降低、在開放臂的運動距離顯著下降，但純涼味劑WS-23及涼味尼古丁氣溶膠暴露小鼠在開放臂的時間和百分比、進入開放臂的次數和百分比并未有顯著性差異，因而未見明顯的戒斷后焦慮反應。Cooper等人的研究（2021）結果表明，薄荷醇添加劑會增強雄性小鼠的尼古丁氣溶膠的自給藥行為，提示薄荷醇口味劑可能對尼古丁的成癮性有增強行為[13]。最近有研究通過大鼠尼古丁自給藥系統的結果表明，薄荷醇對尼古丁依賴有影響；在尼古丁較難獲取時，薄荷醇可抑制尼古丁依賴性[14]，與本實驗結果相比，提示不同涼味劑在尼古丁成癮的不同給藥方式（靜脈給藥或氣溶膠給藥；合并攝入或替代攝入）和不同給藥階段（持續給藥及戒斷）具有不同的神經行為效應。皮質酮含量變化是反映成癮物質戒斷反應的重要生理指標之一[15]，在本實驗中，含尼古丁氣溶膠暴露的小鼠在停止暴露48小時后，血清檢測皮質酮水平都有升高趨勢，提示含尼古丁氣溶膠在小鼠長期暴露后48小時戒斷期可能誘發小鼠生理性戒斷反應[16]，但涼味尼古丁組小鼠的戒斷后血清皮質酮水平較純尼古丁組并無明顯差異[17]。這些小鼠長期氣溶膠暴露研究結果表明，涼味劑WS-23本身不具有獎賞性，而含涼味劑的尼古丁氣溶膠暴露小鼠戒斷后主要表現為運動下降。

3.3 小結與展望

綜合分析，每天半小時的短時程尼古丁氣溶膠暴露在一個月持續慢性暴露條件下，尼古丁氣溶膠并未誘發實驗小鼠明顯的獎賞性行為偏好，涼味劑WS-23氣溶膠長期暴露不改變實驗小鼠的獎賞性行為；相反地，在尼古丁氣溶膠中添加涼味劑WS-23的混合霧化液長期暴露將明顯降低實驗小鼠的獎賞性行為，在氣溶膠暴露戒斷48小時后未見明顯的焦慮行為表征。含尼古丁組（包括純尼古丁組與含WS-23的涼味尼古丁氣溶膠組）長期暴露小鼠的血清皮質酮含量都有升高趨勢。基于以上行為學及血清應激激素皮質酮水平檢測結果推測，電子霧化液空白溶劑和含涼味劑WS-23（5%）的電子霧化液氣溶膠長期暴露未表現出明顯的成癮性，且含WS-23的電子霧化液無促成癮效果；而含尼古丁（4%）的電子霧化液中添加涼味劑WS-23（5%）顯著降低實驗小鼠的獎賞性偏好，同時氣溶膠暴露戒斷48小時后主要表現為運動下降。這些結果提示，電子霧化液成分如涼味劑等口味添加劑與尼古丁混合后對成癮或焦慮等精神行為可能產生交互作用，其可能的機制有待深入研究。本實驗結果表明，不同涼味添加劑的氣溶膠本身以及與尼古丁混合霧化后具有復雜的精神神經效應，而對于此類吸入物質腦功能效應的動物模型研究較少，因此霧化物質的神經效應鑒定與篩選等研究任重道遠。本研究建立了精準定量的電子煙氣溶膠霧化吸入小鼠模型，并為電子霧化產品的成癮性精神作用評估提供科學依據。