半枝蓮-白花蛇舌草藥配伍對乳腺癌肺轉移及細胞增殖的影響研究

周瑋瑋，潘博，唐蔚，任迪莎

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 410006）

“乳巖”是乳腺癌的中醫稱謂，最早關于此病的記載可追溯至東晉年間[1]，但是古中醫并沒有乳腺癌肺轉移相關概念，在相關古籍中轉移核心在于“余毒”“伏邪”等。乳腺癌患者經一系列治療后正氣虧損，既往潛伏的熱毒等乘機入絡，致使氣血失衡、氣滯血瘀、熱蘊毒結、難以消散，最終累及其他部位出現轉移及復發[2]。現代醫學則認為乳腺癌的肺轉移與腫瘤細胞自激注入存在關聯，白介素-6（IL-6）、基質金屬蛋白酶 1（MMP1）和趨化因子CXC基序配體1（CXCL1）表達情況與自激注入強度相關[3]；半枝蓮與白花蛇舌草抗腫瘤功效已經得到臨床認證，本文旨在探討上述中藥配伍后對乳腺癌肺轉移的影響及抑制腫瘤細胞增殖效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所需的大鼠均從上海中科院動物實驗室購買，且均為雄性大鼠，級別為SPF級，屏障系統內飼養，體質量（125.31±10.02）g，獲得實驗動物使用許可相關證明。所用的儀器包括酶聯免疫檢測分析儀、流式細胞儀、熒光顯微鏡、安全生物柜、細胞培養箱等，試劑包含DMEM培養基、胎牛血清、四甲基偶氮唑鹽（MTT）等。

1.2 方法

依計劃，觀察1組細胞培養物滴入半枝蓮、白花蛇舌草藥對混合液，觀察2組單獨應用半枝蓮，對照組滴入無菌生理鹽水。

肺轉移細胞株檢測[4]：選取上海中科院生產的人高轉移性乳腺癌細胞株（MDA231-LM2細胞），在安全生物柜內完成所有操作。DMEM培養基中加入1%濃度青霉素、鏈霉素雙抗及10%的胎牛血清，將細胞株置入細胞培養液中，于5% CO2+37℃的環境下恒溫培養。同時制作含藥血清，按人鼠等效劑量標準分別換算出大鼠對半枝蓮單獨用藥劑量及半枝蓮-白花蛇舌草合用時劑量，即觀察1組、觀察2組，煎水后連灌3 d；對照組大鼠連灌3 d生理鹽水，3 d后制取大鼠含藥血清。取Invitrogen公司生產的合成引物及其序列表，將培養后的MDA231-LM2細胞進行重懸，截取出6×105數量的細胞置入圓皿中，加入含藥血清，濃度控制在10%，混合物放于5% CO2、37℃環境下24h，棄上清后加入Trizol，使得細胞完全充分裂解。逆轉錄總RNA，擴增PCR后提取mRNA并逆轉錄，制定反應體系，配制反應液，PCR反應后采集熒光信號，記錄IL-6、MMP1 和CXCL1表達情況。

細胞增殖檢測[5]：選擇上海中科院生產的人乳腺癌細胞MDA-MB-231進行研究，將量為1×105/ml處于對數生長期的細胞接種至孔板中，共96孔，每孔細胞數量為100 μl，培養箱內放置24 h后分別加入半枝蓮溶液、半枝蓮-白花蛇舌草溶液及生理鹽水，即觀察2組、觀察1組及對照組，每孔再加入MTT溶液10 μl，完成4 h的孵育，棄去上清，再加入DMSO 150 μl，振蕩后以酶聯免疫法檢測波長570 nm的吸收值，抑制率計算公式=（1-觀察組均值/對照組均值）×100%。

1.3 觀察指標

以肺轉移細胞株mRNA上轉移因子及腫瘤細胞570 nm吸收值作為觀察項目，前者指標包括IL-6、MMP1及CXCL1；后者為用藥不同時間段細胞吸收值的比較。

1.4 統計學分析

數據均錄入SPSS 25.0軟件進行處理，計量資料以（均數±標準差）表達，行t檢驗，檢驗水準為0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠細胞株中腫瘤轉移相關因子水平比較

觀察組各組mRNA中IL-6、CXCL1、MMP1水平均低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），且觀察1組上述指標水平則低于觀察2組（P<0.05），見表1。

表1 兩組腫瘤轉移因子比較

2.2 各組不同時間細胞波長吸收值比較

觀察1組、2組細胞各時段570nm細胞吸收值均小于對照組，差異均具有統計學意義（P<0.05）；且觀察1組12h、24h及48h吸收值明顯小于觀察2組（P<0.05），觀察1組抑制率明顯高于觀察2組，且隨著時間推移、抑制率更高。見表2。

表2 各組不同時間細胞波長吸收值比較

3 討論

3.1 乳腺癌腫瘤細胞肺轉移與IL-6、CXCL1、IL-8、MMP1的關系

肺與骨是乳腺癌轉移較常發生的兩個部位，有資料統計[6-7]，肺轉移后患者中位生存期可縮短至25個月。腫瘤細胞侵襲肺部后可造成肺組織損傷及功能受損，可表現為咯血、胸悶、胸痛等，嚴重影響患者生存質量。且相關研究發現[8-9]，乳腺癌手術后發生遠處轉移及原位復發與自激注入有關，位于原發腫瘤的循環腫瘤細胞自原位脫落隨血液或淋巴循環種植在其他器官活組織并且能返回至原發位置繼續刺激腫瘤發展，因此乳腺癌的肺轉移與循環腫瘤細胞密切相關。在腫瘤的自激注入過程中，乳腺癌腫瘤細胞以信號釋放方式誘導循環腫瘤細胞穿過組織黏膜內皮定植，后者會促使機體生成新生血管、炎性細胞活化相關調控因子[10]，進一步加快腫瘤的生長。與循環腫瘤細胞、自激注入有關的基因因子包括IL-6、CXCL1、IL-8、MMP1等，其中IL-6能對循環腫瘤細胞中侵襲性強的細胞產生吸引作用，CXCL1、MMP1則能調節循環腫瘤細胞的侵襲能力及局部浸潤能力，故本實驗將IL-6、CXCL1、MMP1作為乳腺癌腫瘤細胞肺轉移風險指標，分析其臨床意義。

3.2 半枝蓮-白花蛇舌草藥配伍對乳腺癌肺轉移腫瘤轉移相關因子水平的影響

本研究中觀察組各組mRNA中IL-6、CXCL1、MMP1水平均低于對照組，且觀察1組上述指標水平則低于觀察2組（P<0.05），說明IL-6、CXCL1、MMP1水平與乳腺癌腫瘤細胞肺轉移有關，且不用中醫治療方案對腫瘤轉移相關因子水平的影響不一。

中藥是現代中醫重要組成部分，半枝蓮、白花蛇舌草在腫瘤治療方面優勢多有報道[11]，乳腺癌在中醫稱為“乳巖”，發生肺轉移的證型多為熱毒蘊結證，而半枝蓮清熱解毒、化瘀利尿，白花蛇舌草亦能清熱解毒、利濕通淋；從分子藥理學角度而言，半枝蓮對于腫瘤細胞活化相關因子有較好抑制效果，白花蛇舌草則能推動腫瘤細胞的代謝與凋亡，故表1提示相較于空白對照組，半枝蓮單獨用藥（觀察2組）及與白花蛇舌草聯合用藥（觀察1組）均能極大地降低高轉移細胞株mRNA上各因子表達，對乳腺癌肺轉移有一定抑制能力。藥對是中醫中最小組方的復方中藥，既可保存單味中藥的藥理特性，又能以組藥形式相互促進、增加藥理層次，提高藥物療效，表1中觀察1組以藥對方式用藥后對各促轉移因子控制效果更好，提示半枝蓮-白花蛇舌草能抑制乳腺癌細胞自激注入能力，降低轉移概率。

3.3 半枝蓮-白花蛇舌草對乳腺癌細胞增殖的影響

藥理研究顯示，半枝蓮提取物能抑制β-連環蛋白活化進程，抑制MMP1表達水平及轉錄因子，對腫瘤細胞有絲分裂起阻滯作用，進而控制細胞增殖速度、減緩腫瘤生長速度、抑制循環腫瘤細胞活化、促進腫瘤細胞凋亡[12]。白花蛇舌草提取物除能抑制MMP1外，還能抑制與之相關的MMP2、MMP9，同時對血管生成活化通路形成抑制，加快細胞凋亡進程[13]。半枝蓮、白花蛇舌草均能減緩腫瘤細胞的復制進程，控制腫瘤區域新生血管的生成，進一步減少腫瘤組織血液供應，因此對減緩異常細胞增殖有積極作用，且阮祥美等[14]的研究亦認為半枝蓮-白花蛇舌草是中醫治療乳腺癌的核心藥對，表2顯示，隨著用藥時間得延長，半枝蓮、白花蛇舌草對乳腺癌細胞的抑制率逐級提升，且藥對用藥時控制細胞增殖效果更佳。

綜上所述，乳腺癌采取百枝蓮-白花蛇舌草配伍為藥對后治療能通過控制腫瘤細胞分化及腫瘤循環細胞活性，阻礙腫瘤細胞分化、復制進程，降低肺轉移風險，并可有效抑制細胞增殖速度，臨床治療時可考慮此方面用藥，但仍需進行充分的臨床用藥研究，以獲得更多的人體用藥數據。