耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的基因組分型及耐藥性評估

鄭軍濤，胡會

（河南省西華第一醫院檢驗科，河南 周口 466600）

肺炎克雷伯菌廣泛存在于自然界中，是最為常見的機會致病菌之一，可直接引發多種感染疾病，如菌血癥、尿路感染、肝膿腫等[1]。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌是臨床中較為常見的耐藥菌，目前尚無有效對應治療手段，直接導致病死率升高，引發了廣泛關注[2]。在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的傳播性調查研究中，全基因組測序技術和基于全基因組序列的分型技術被廣泛應用，在菌株鑒別、傳播鏈識別等方面發揮了良好作用[3]。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應用，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥率逐漸提升，給臨床對癥治療、預防控制醫院感染帶來了較大困難，并且對人類健康造成了極大威脅[4]。因此，對于肺炎克雷伯菌的臨床感染分布、基因組分型，特別是耐藥性分析對臨床合理控制其傳播顯得尤為重要[5]。本研究主要探究耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌院內分布狀況、基因組分型情況及耐藥性趨勢，為臨床中合理使用碳青霉烯類抗菌藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及分離鑒定

134株肺炎克雷伯菌株分離自2021年1月—9月本院患者的不重復送檢樣本，包括痰液、尿液、膿液、血液等，其中共分離出68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株。所有肺炎克雷伯菌的培養、分離和鑒定均按照《全國臨床檢驗操作規程》（第4版）[6]進行。

1.2 全基因組測序及分析

使用菌株ZZYF002的基因組序列作為參考序列，使用bowtie2軟件將其他菌株的基因組與之比對，使用Samtools軟件鑒定所有菌株基因組的共有SNP。將序列比對至耐藥基因數據庫中，查找耐藥性相關基因的名稱，挑選分析每株菌的耐藥基因，包括blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM和blaOXA-48，將每株菌的全基因組序列與MLST網站（http：//bigsdb.pasteur.fr/）公布的肺炎克雷伯菌MLST分型的7個管家基因rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB的片段序列進行比對，獲得每個位點的等位基因編號以及菌株的MLST型別。

1.3 藥敏方法

采用K-B紙片法藥敏試驗，通過細菌分析儀觀察68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株對氨芐西林、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢噻肟、阿米卡星、環丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、亞胺培南、美羅培南等10種抗菌藥物的耐藥性，結果根據美國臨床實驗室標準化研究所2015版標準進行判斷。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析。計數資料以（n）和（%）]進行描述。

2 結果

2.1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株分布

分離的68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株大部分來源于痰液和尿液標本，分別為69.66%和19.05%；科室分布以重癥監護室、呼吸內科為主，具體見表1。

表1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株分布

2.2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株的基因分型

基于全基因組序列分析，68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌MLST分型分為4種不同的型別，其中有65株為ST11型；1株ST219型菌株攜帶blaNDM-1基因，1株ST11型菌株攜帶blaKPC-11基因，1株ST11型菌株同時攜帶blaKPC-2和blaNDM-1基因，其余63株ST11型、1株ST15型和1株ST2237型菌株均攜帶blaKPC-2基因，未檢出blaIMP、blaVIM和blaOXA-48基因，具體見表2。

表2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株的基因分型

2.3 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株對10種抗菌藥物的耐藥率分析

68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株對氨芐西林、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢噻肟耐藥率高達95.00%以上，具體見表3。

表3 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株對10種抗菌藥物的耐藥率分析[n（%）]

3 討論

ST11型是我國耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株的主要流行MLST型[7]。我國報道的第1株ST11型耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株于2007年成功分離[8]。本研究結果顯示，攜帶blaKPC-2基因是ST11型菌株產生碳青霉烯類抗生素耐藥性的主要機制，提示攜帶blaKPC-2基因的ST11型耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株已經在我國流行了多年。

3.1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株分布情況

本研究結果顯示，分離的68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株大部分來源于痰液和尿液標本，分別為69.66%和19.05%，科室分布以重癥監護室、呼吸內科為主。據此證實耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株在院內各科室中已廣泛分布，究其原因是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株可通過患者間交叉感染、人工呼吸機等醫療器械進行傳播，其主要分布在重癥監護室、呼吸內科，是因為這些科室的患者病情較為嚴重，免疫力水平較低、患病時間較長、聯合使用了多種抗菌藥物等；且以痰液、尿液標本為主，說明其常引起的癥狀為呼吸道感染、泌尿系感染，與相關文獻報道[9]一致。

3.2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株的基因分型

基于全基因組序列分析，68株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌MLST分型分為4種不同的型別，其中有65株為ST11型；1株ST219型菌株攜帶blaNDM-1基因，1株ST11型菌株攜帶blaKPC-11基因，1株ST11型菌株同時攜帶blaKPC-2和blaNDM-1基因，其余63株ST11型、1株ST15型和1株ST2237型菌株均攜帶blaKPC-2基因，未檢出blaIMP、blaVIM和blaOXA-48基因，與徐慧等[10]研究類似。該結果說明耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌主要以攜帶blaKPC-2基因進行傳播，并且已經開始獨立流行傳播，醫療機構可以對應發展相關基因組水平技術手段，應用于耐藥菌的日常監測，并結合臨床診療數據，及時采取措施加以防控。

3.3 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株對10種抗菌藥物的耐藥率比較

本研究中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對多種抗菌藥物產生耐藥，除慶大霉素、左氧氟沙星耐藥率低于90.00%外，氨芐西林、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢噻肟耐藥率高達95.00%以上，高于相關報道的檢出率[11]，其原因可能與不同地區、醫院的抗菌用藥使用頻率有關，同時也說明我院在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株引起相應感染時的控制工作較差；其次是因為碳青霉烯類抗生素是具有廣譜耐藥活性的β-內酰胺抗生素，隨著碳青霉烯酶的基因分型重合率上升，多重耐藥菌株以及泛耐藥菌株的數量也逐年上升。

綜上所述，攜帶blaKPC-2基因的ST11型耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株已在院內各科室廣泛分布，且對各抗菌藥物的耐藥率有所增加。因此，應引起臨床重視，合理使用抗菌藥物。