丹參酮ⅡA調控Sirt1通路影響巨噬細胞極化的機制研究

宋璐霞，張 杰，馬 丹，樊懿萱，劉啟予，趙 麟，徐 浩，3

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是發生于動脈血管壁(主要累及大中肌性動脈)的慢性疾病，是冠心病、高血壓等多種心腦血管疾病的危險因素。巨噬細胞作為動脈粥樣硬化斑塊中的主要炎性細胞，在促進早期斑塊形成、稀釋纖維帽和核心壞死成分、增強免疫應答反應等方面具有重要作用[1]。巨噬細胞在不同因素刺激下發生表型的分化即巨噬細胞極化，可分為M1、M2 型巨噬細胞。M1 型巨噬細胞能夠分泌促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6、IL-1β、趨化因子配體-5(CCL-5)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等[2]參與炎癥反應過程；而M2型巨噬細胞則主要參與組織重塑及炎癥消退過程[3]。

丹參為唇形科植物丹參的干燥根和根莖，具有活血化瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰的功效。丹參酮ⅡA為丹參的脂溶性有效活性成分，已有大量臨床及基礎研究顯示其具有抗炎、抗氧化應激等作用，在保護血管內皮細胞功能、抗動脈粥樣硬化中發揮重要作用[4-6]。然而，丹參酮ⅡA從影響巨噬細胞極化角度探索抗炎作用的實驗證據尚待完善。故本實驗以脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7巨噬細胞為體外炎癥細胞模型為研究對象，從巨噬細胞極化角度出發探討丹參酮ⅡA抗炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及藥品 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自武漢普諾賽生命科技有限公司；丹參酮ⅡA購自美國APExBIO公司，N184611337769；LPS購自Solarbio公司，L8880。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養基(Gibico公司，C11885500BT)；CCK-8 試劑盒(賽百科公司，F25)；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、TurboFectTMTransfection Reagent、SuperScriptⅢ逆轉錄試劑盒、Sybr qpcr mix均購自THERMO公司；T4 DNA Ligase(Transgen公司，FL101-01)；封閉專用脫脂奶粉(北京普利萊公司，P622，2021MOAP1622)；10x電轉液(北京Solarbio公司，D1060，批號20210220)；5xTris-甘氨酸電泳緩沖液(北京Solarbio公司，D1060)；二哇啉甲酸(BCA)蛋白質定量試劑盒(北京普利萊公司，P1511)；4×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠緩沖液(北京Solarbio公司，S1051，批號20201217)；一抗：Sirt1、F4/80、β-actin(Abcam公司，ab189494、ab6640、ab8227)、CD206/MMR(RD公司，AF2535)，過氧化物酶增生激活受體-γ(PPAR-γ)、iNOS、核轉錄因子(NF)-kBp65、Arg1抗體(CST公司)；二抗：山羊抗兔IgG HRP、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor?647)Abcam公司；驢抗兔 IgG(minimal x-reactivity)、FITC標記抗鼠二抗均購自Biolegend公司；Sirt1干擾RNA由湖州河馬生物設計合成；各指標引物由北京梓熙生物科技有限公司合成。YCP系列氣套二氧化碳(CO2)培養箱(中國華曦公司)；BeamCyte-1026流式細胞儀(中國必達科公司)；3-30K低溫離心機(德國 Sigma公司)；Nanodrop lite分光光度計(購自美國THERMO公司)；熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)儀(美國Applied Biosystems公司)；SDS-PAGE電泳系統(美國Bio-rad公司)；ChemiDoc MP化學發光成像系統(美國Bio-rad公司)；凝膠成像系統(美國Bio-rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 RAW264.7巨噬細胞使用10% FBS-DMEM培養基(含100 kU/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素)，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，每日觀察細胞形態，RAW264.7最佳形態為小的圓形透亮細胞[7]，待細胞生長密度為80%～90%后使用 0.25%的胰蛋白酶消化2 min進行傳代培養。

1.3.2 Sirt1干擾技術 采用qPCR法篩選最佳Sirt1敲降效果的siRNA(引物序列見表1)，構建干擾載體，將慢病毒包裝質?；旌衔锛氨磉_質粒使用無菌超純水分別稀釋為終濃度為1.0 μg/μL 的質粒溶液。在無菌1.5 mL EP管中加入400 μL無血清培養基，加入1.5 μg核心質粒和1.5 μg病毒包裝質粒，及6 μL turbofect充分混勻，靜置15～20 min，將混合液逐滴加入HEK-293T細胞中，48 h后吸取上清，補入培養基，繼續培養。24 h后收集上清，將兩次收集的上清液混合，得到病毒液。0.45 μm濾膜過濾病毒液，-80 ℃保存用于后續感染誘導的巨噬細胞模型。

表1 mSirt1 siRNA合成序列

1.3.3 丹參酮ⅡA給藥濃度篩選 于96孔板中以1×105

每孔接種RAW264.7細胞，分為對照組及丹參酮ⅡA各劑量組(濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL)，細胞培養24 h后，應用CCK-8法檢測細胞存活率，細胞存活率=[(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)]×100%，選定細胞給藥濃度。

1.3.4 炎癥模型構建與分組 使用100 ng/mL LPS刺激RAW264.7細胞24 h構建巨噬細胞炎癥模型。分為空白組、模型組、Sirt1敲降組(模型+Sirt1 RNA干擾)、丹參酮ⅡA組(模型+丹參酮ⅡA)及Sirt1敲降+丹參酮組(模型+Sirt1 RNA干擾+丹參酮ⅡA)。

1.3.5 流式細胞術檢測 各組細胞藥物干預24 h后，0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，重懸細胞并進行細胞計數。調整細胞濃度為1×107/mL，取100 μL 細胞懸液，加入對應的一抗 4 ℃孵育30 min，二抗 4 ℃、避光孵育30 min，經1%多聚甲醛 4 ℃固定30 min后上機檢測。M1型巨噬細胞以F4/80+/iNOS標記，M2型巨噬細胞以F4/80+/CD206+標記。

1.3.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測相關指標 收集各組細胞，使用5倍細胞體積RIPA裂解液提取巨噬細胞總蛋白，BCA蛋白法測定蛋白濃度，以每孔20 μg蛋白質上樣進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后將蛋白條帶轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1等一抗，4 ℃孵育過夜，第2日應用TBST洗膜3次，加入相應二抗，室溫搖床孵育1 h，電化學發生(ECL)法顯影成像，Image J軟件對各組條帶灰度值進行分析。

1.3.7 RT-qPCR檢測mRNA表達情況 收集并提取各組細胞mRNA，使用逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，各組細胞 Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1的 mRNA 表達水平(引物序列見表2)。反應條件：95 ℃預處理5 min，循環 1 次；95 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環40次，每組設3個復孔。相對表達量計算公式：RQ=2-(△Ctq-ΔCtcb)，△Ctq=待測組目的基因平均Ct值-待測組內參基因平均Ct值，△Ctcb=對照組目的基因平均Ct值-對照組內參基因平均Ct值。

表2 各指標引物序列

2 結 果

2.1 qPCR篩選siRNA 提取各組Sirt1表達干擾細胞的mRNA行qPCR檢測。與對照組比較，si-RNA-NC組、Si-RNA-1組、Si-RNA2組對Sirt1基因表達的干擾差異無統計學意義(P>0.05)，si-RNA-3組對Sirt1基因表達的干擾差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 siRNA轉染RAW264.7細胞對Sirt1表達的影響(±s)

2.2 CCK-8法檢測各濃度丹參酮ⅡA細胞存活率 與對照組比較，丹參酮ⅡA 5 μg/mL組、丹參酮ⅡA 10 μg/mL組、丹參酮ⅡA 20 μg/mL組RAW264.7巨噬細胞存活率差異均無統計學意義(P>0.05)，說明丹參酮ⅡA對RAW264.7細胞無明顯細胞毒作用。詳見表4。本實驗選擇丹參酮ⅡA 20 μg/mL濃度進行后續藥物干預。

表4 不同濃度丹參酮ⅡA對RAW264.7細胞活力影響(±s)

2.3 流式細胞術檢測各組M1型、M2型巨噬細胞 本實驗流式圖像分析均使用雙參數散點圖，按照“十”字四象限進行設置(Q1-1至Q1-4)，每象限內以“%”表示不同細胞亞群分布百分比。橫坐標及縱坐標分別表示各熒光標記的抗體與目標細胞表面結合熒光強度。M1型巨噬細胞以F4/80+/iNOS+為標記，Q1-2象限內表示M1型巨噬細胞分布情況。與模型組比較，Sirt1敲降組M1巨噬細胞數量明顯增多，差異有統計學意義(P<0.001)，丹參酮ⅡA組及Sirt1敲降+丹參酮組M1型巨噬細胞數量則明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.001)；在對Sirt1基因敲降基礎上予丹參酮ⅡA干預后能明顯減少M1型巨噬細胞表達，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見圖1、表5。

圖1 各處理組對M1型巨噬細胞分布影響

表5 各組對M1型巨噬細胞分布百分比比較(±s)單位：%

M2型巨噬細胞以F4/80+/CD206+為標記，圖2中Q1-2象限中為M2型巨噬細胞表達情況。與模型組比較，丹參酮ⅡA組及Sirt1敲降+丹參酮組M2型巨噬細胞數量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)，Sirt1基因敲降使M2型巨噬細胞數下降，但差異無統計學意義(P>0.05)；與Sirt1敲降組比較，Sirt1敲降+丹參酮組M2巨噬細胞數量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見表6。

圖2 各組M2型巨噬細胞分布情況

表6 各組對M2型巨噬細胞分布百分比比較(±s)單位：%

2.4 Western Blot檢測各組Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1蛋白表達 與模型組比較，丹參酮ⅡA能夠明顯上調Sirt1以及M2型巨噬細胞標志蛋白Arg1表達，差異有統計學意義(P<0.01)，減少炎癥相關NF-κB以及M1型巨噬細胞標志蛋白iNOS表達，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，丹參酮ⅡA能上調PPAR-γ蛋白表達，但差異無統計學意義(P>0.05)；在對細胞進行Sirt1基因敲降后，敲降組Sirt1、PPAR-γ明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)，NF-κB、iNOS、Arg1表達升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；與Sirt1敲降組比較，Sirt1敲降+丹參酮組Sirt1表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，PPAR-γ及Arg1表達增加，但差異無統計學意義(P>0.05)，NF-κB、iNOS呈下降趨勢，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖3、表7。

圖3 丹參酮ⅡA 對Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1蛋白表達影響

表7 各組Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1蛋白表達比較(±s)

2.5 各組Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1 mRNA表達比較 與空白組比較，模型組Sirt1、PPAR-γ mRNA表達明顯下調，差異有統計學意義(P<0.001)，NF-κB及iNOS mRNA表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.001)；與模型組比較，丹參酮ⅡA組能夠明顯上調Sirt1、PPAR-γ、Arg1 mRNA表達，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，抑制NF-κB、iNOS mRNA表達，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，Sirt1敲降組Sirt1、PPAR-γ mRNA表達減少，NF-κB、iNOS、Arg1 mRNA表達升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；與Sirt1敲降組比較，Sirt1敲降+丹參酮組Sirt1、PPAR-γ、Arg1 mRNA表達增多，但差異無統計學意義(P>0.05)，NF-κB、iNOS mRNA表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表8。

表8 各組Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1 mRNA表達影響(±s)

3 討 論

動脈粥樣硬化所致的血管管腔狹窄及易損斑塊的破裂繼發血栓是冠心病的主要病理改變，這與中醫學中的“血瘀”“血脈瘀阻”有諸多相似之處。陳可冀院士團隊采用病證結合方法，提出冠心病主要中醫病機為“心血瘀阻，血脈不通”，并提出“瘀毒致變”引發急性心血管事件的假說[8-9]，推動了活血解毒中藥治療冠心病的臨床實踐與科學研究。丹參作為活血化瘀的主要藥物，被廣泛應用于心血管疾病的治療實踐中。

炎癥反應貫穿了動脈粥樣硬化發生、發展的全過程，巨噬細胞作為斑塊進展的主要參與者，M1 型巨噬細胞增多導致炎性因子分泌增加，損傷內皮細胞導致斑塊纖維帽變薄更易破損，成為易損斑塊，加速疾病進展；M2 型巨噬細胞增多則導致脂質核心外部的M2型巨噬細胞可吞噬凋亡的M1型巨噬細胞，有助于炎癥消退，防止斑塊破裂，使斑塊趨于穩定，抑制動脈粥樣硬化發展[10-11]。沉默信息調節因子Sirtuin(Sirt)家族蛋白(Sirt-7)具有廣泛的生物學作用，包括參與脂質代謝、炎癥反應、細胞凋亡等[12]。Sirt1基因表達缺失會介導氧化應激、炎癥反應的發生[13]，抑制PPAR-γ激活、誘導NF-κB活化促使巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化[14]。反之，PPAR-γ表達上調能夠促進巨噬細胞向M2表型極化。有研究發現，內皮細胞中Sirt1能夠催化NF-κB去乙?；?，抑制其過度激活，降低組織因子表達和動脈血栓形成[15]，降低凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(Lox-1)進而緩解泡沫細胞形成，增加易損斑塊穩定性[16]?？梢?，Sirt1/PPAR-γ/NF-κB信號通路在調控巨噬細胞極化，抑制炎癥反應，延緩動脈粥樣硬化進展，維持斑塊穩定性中發揮重要作用。然而巨噬細胞的種類不僅止于M1、M2型，與人類疾病發展密切相關的部分巨噬細胞的起源和特征仍尚未明確，比如CD169+巨噬細胞、TCR+巨噬細胞和腫瘤相關巨噬細胞[17]。

本研究發現，丹參酮ⅡA能夠明顯下調RAW264.7巨噬細胞炎癥模型中M1型巨噬細胞分布，提高M2型巨噬細胞數量，上調Sirt1、PPAR-γ、Arg1等通路蛋白及mRNA表達，抑制NF-κB、iNOS蛋白和mRNA表達。在對RAW264.7巨噬細胞炎癥模型進行Sirt1基因敲降后，M1型巨噬細胞數量較模型組明顯升高，M2型巨噬細胞數量則有所下降但差異不明顯，但總體呈促炎趨勢。對應的Sirt1、PPAR-γ蛋白及mRNA明顯減少，然而Arg1并沒有如預期中下調，反而有所升高，NF-κB、iNOS蛋白和mRNA表達升高。M1和M2型巨噬細胞極化是一個動態而連續的過程，因此考慮處于二者轉化過程中巨噬細胞可能會同時表達個別標志物，故推測這是Sirt1敲除后導致Arg1不降反增的可能原因。

綜合上述研究結果，認為丹參酮ⅡA能夠通過調控Sirt1/PPAR-γ/NF-κB 信號通路，調控M1、M2型巨噬細胞極化抑制炎癥反應發生，進而緩解動脈粥樣硬化發展，但在此過程中其他類型巨噬細胞是否參與以及如何干預，有待深入探索。