紫檀芪調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路保護心肌缺血再灌注損傷大鼠的作用機制研究

付華君，孟 娟，宋文英，蔣延安，楊 瑞

當(dāng)前，隨著人們生活水平的提高及人口老齡化社會的到來，心腦血管相關(guān)疾病發(fā)病率也逐年升高，已成為嚴(yán)重危害健康的一類疾病，以冠心病為例，2020年我國冠心病病人超過1 100萬例，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量[1-2]。急性心肌梗死為冠心病最常見的死亡原因，冠狀動脈硬化斑塊破裂后形成血栓并阻塞血管，在一定時間內(nèi)血流再次恢復(fù)供應(yīng)，造成心肌損傷進行性加重，這一過程稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MI/RI)[3]。本病發(fā)生機制較為復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、自由基異常、線粒體損傷、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡和壞死、炎癥刺激等[4-5]。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路是重要的信號通路之一。研究報道，以PI3K/Akt/mTOR信號通路為評價指標(biāo)，可能對心肌缺血再灌注損傷康復(fù)研究具有積極的意義[6]。本研究構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷動物模型，擬從PI3K/Akt/mTOR信號通路研究紫檀芪的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠72只，雌雄各半，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，體質(zhì)量160～180 g，動物合格證號：SCXK(陜)2014-002。購買后飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)動物實驗中心。

1.2 藥品及試劑 紫檀芪購于薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司(貨號：A01E1003520050)；阿司匹林注射液購于哈藥集團生物工程有限公司(批號H20084565)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒均購于武漢華美生物工程有限公司(貨號分別為：CSB-E14403r，CSB-E13023r和CSB-E11324r)；炎性因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司(批號分別為：EK0393，EK1742和EK0526)；相關(guān)一抗包括PI3K、Akt、mTOR、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶體蛋白(p-mTOR)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購于美國cell signaling technology公司(貨號分別為：4249S，9272S，15006S，4288s，9611S，5536S和5174S)；二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(貨號：TA09)；牛血清蛋白、總蛋白提取試劑盒購于Sigma-Aldrich公司(貨號分別為：V900933和TP0100)。

1.3 實驗儀器 彩色多普勒超聲便攜機(BLS-X3型，武漢醫(yī)盾醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))；酶標(biāo)儀(DNM-9606型，南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn))；低溫高速離心機[Sorvall Legend Micro 17型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產(chǎn)]；分析級天平[EX225ZH/AD型，奧豪斯儀器(上海)有限公司生產(chǎn)]；電泳槽(Mini Pro3型，美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司生產(chǎn))，電泳儀(Bio-Rad Mini型，美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司生產(chǎn))。

1.4 實驗分組與給藥 按照隨機數(shù)字法將SD大鼠分為假手術(shù)組、心肌缺血再灌注損傷組(MI/RI組)、紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組和阿司匹林組，每組12只。假手術(shù)組和MI/RI組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃，紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組分別給予紫檀芪10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg灌胃，阿司匹林組則給予30 mg/kg阿司匹林灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃2周。

1.5 MI/RI模型的構(gòu)建 各組大鼠均于末次給藥1 h后分批次構(gòu)建MI/RI動物模型。采用異氟醚將大鼠麻醉后固定于手術(shù)臺上，胸部皮膚消毒后，于左側(cè)第3肋和第4肋骨間進行開胸手術(shù)，開胸后暴露心臟，找到冠狀動脈后進行穿線，除假手術(shù)組不結(jié)扎外，其余5組均進行結(jié)扎手術(shù)，結(jié)扎時間為30 min，30 min后恢復(fù)結(jié)扎線給予再灌注2 h即可，完成后按照流程處置動物、收集樣本。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 心功能檢測 所有大鼠均于再灌注2 h后采用多普勒超聲儀檢測左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室短軸縮短率(LVFS)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，評價結(jié)果為檢測3次的平均值。

1.6.2 心肌梗死面積測定[7]處死大鼠后快速取出心臟組織，用4 ℃生理鹽水充分洗滌心腔內(nèi)血液后置入-20 ℃冰箱冷凍25 min。上述完成后用切片刀沿結(jié)扎線與房室溝的平行方向橫切成5 片，每片厚約2 mm，用1%氯代三苯基四氮唑(TTC)溶液于37 ℃染色15 min，完成后用10%的甲醛溶液固定，取出后即可看到正常心肌組織為紅色，而梗死區(qū)的心肌組織為白色，將其進行拍照，完成后采用Image J計算心肌梗死面積，梗死面積為缺血區(qū)域的面積占左心室的面積百分比。

1.6.3 血清指標(biāo)測定 建模成功后2 h，抽取腹主動脈血3～7 mL(取血中盡量保證多抽取，根據(jù)統(tǒng)計最少為3 mL，最多為7 mL)，4 000 r/min離心5 min后提取上清液，按照試劑盒說明書檢測CK-MB、AST、LDH、IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.6.4 心肌組織形態(tài)學(xué)觀察 稱取部分心肌組織，置于4%的多聚甲醛溶液中固定24～72 h后，分批次進行蘇木精-伊紅(HE)染色完成后封片，采用帶有照相功能的普通光學(xué)顯微鏡觀察采集圖像。每張切片選取4個不同的視野。

1.6.5 蛋白表達檢測 稱取部分心肌組織，采用Sigma-Aldrich總蛋白提取試劑盒提取總RNA，采用二喹啉甲酸(BCA)進行定量后調(diào)平，然后每組各取50 μg行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，牛血清蛋白封閉2 h后，一抗過夜孵育，次日取出加入二抗孵育30 min，暗室曝光洗片，采用灰度值/GAPDH的灰度值檢測p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白值。

2 結(jié) 果

2.1 各組心功能指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，MI/RI 組大鼠心臟LVESD和LVEDD值明顯升高，LVEF和LVFS值明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與假手術(shù)組比較，紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組和阿司匹林組LVESD值明顯升高，LVEF和LVFS值明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 MI/RI 組比較，紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組和阿司匹林組LVESD明顯降低，LVFS和LVEF值明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較(±s)

2.2 各組心肌梗死面積及心肌酶比較 與假手術(shù)組比較，MI/RI組、紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組和阿司匹林組心肌梗死面積、CK-MB、LDH和AST均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MI/RI組比較，紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組和阿司匹林組心肌梗死面積、CK-MB、LDH、AST均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組心肌梗死面積及心肌酶含量比較(±s)

2.3 各組血清炎性因子含量比較 與假手術(shù)組比較，MI/RI組、紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組和阿司匹林組IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MI/RI組比較，紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組和阿司匹林組IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；紫檀芪中劑量和高劑量組IL-6、TNF-α含量均明顯低于阿司匹林組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組血清炎性因子含量比較(±s)單位：pg/mL

2.4 各組大鼠心肌組織病理學(xué)比較 假手術(shù)組心肌纖維排列整齊；MI/RI組可見明顯的心肌斷裂和出血，也可直接看到心肌損傷；與MI/RI組比較，紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組和阿司匹林組均有心肌纖維部分?jǐn)嗔眩帕谐室?guī)則，明顯好轉(zhuǎn)，但仍沒有假手術(shù)組心肌纖維排列整齊。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果(×400)

2.5 各組大鼠心肌組織 PI3K/Akt/mTOR 信號通路相關(guān)蛋白表達比較 與假手術(shù)組比較，MI/RI組、紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組和阿司匹林組p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與MI/RI組比較，紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組和阿司匹林組p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4、圖2。

表4 各組大鼠心肌組織PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達比較(±s)

圖2 各組大鼠心肌組織中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達電泳圖(A為假手術(shù)組；B為MI/RI組；C為阿司匹林組；D為紫檀芪低劑量組；E為紫檀芪中劑量組；F為紫檀芪高劑量組)

3 討 論

紫檀芪首先發(fā)現(xiàn)于紫檀，是紫檀中的主要藥理活性成分之一，近年來研究發(fā)現(xiàn)，其在藍(lán)莓和龍血竭中含量也較多，具有開發(fā)價值[8]。當(dāng)前關(guān)于紫檀芪的研究較少，而關(guān)于與其結(jié)果相似的另一種中藥單體白藜蘆醇的研究較多[9]。研究發(fā)現(xiàn)，紫檀芪和白藜蘆醇具有相似的藥理活性，且紫檀芪的藥理活性優(yōu)于白藜蘆醇，主要是因為紫檀芪的脂溶性較高，更易被人體吸收、利用[10-11]。已有研究將紫檀芪用于代謝性疾病及相關(guān)心腦血管疾病的治療[12]。趙瑋等[13]研究發(fā)現(xiàn)，紫檀芪對心肌缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用，并分析其作用機制可能與調(diào)節(jié) Notch1 /eIF3a 信號通路，進而降低炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察紫檀芪對心肌缺血再灌注的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫檀芪預(yù)防給藥能夠升高LVFS 和 LVEF，降低LVESD值，提示紫檀芪對心臟功能具有保護作用；紫檀芪可有效降低缺血再灌注心肌梗死面積、改善心功能，進一步證明了紫檀芪對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

心肌缺血再灌注損傷與炎癥刺激關(guān)系密切，在眾多的炎癥相關(guān)信號通路中，PI3K/Akt/mTOR 信號通路是經(jīng)典的信號通路之一[7]，在PI3K/Akt/mTOR信號通路中，mTOR蛋白是其執(zhí)行蛋白，mTOR屬于一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在執(zhí)行功能時可以形成mTOR1(mTORC1)和mTOR2(mTORC2)兩種類型，二者均可以有效調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、調(diào)控蛋白質(zhì)合成，同時抑制炎性因子過量表達等，而控制mTOR表達翻譯和磷酸化的主要調(diào)控因子為PI3K/Akt 信號通路，PI3K/Akt信號通路也是與mTOR 關(guān)系最為密切的信號傳導(dǎo)途徑之一[14-15]。PI3K和Akt 蛋白多數(shù)情況下是生命活動所必需的，但是在受到相關(guān)外界因子的刺激后，可引起其結(jié)構(gòu)發(fā)生磷酸化，這兩種磷酸化的PI3K和Akt可直接激活 mTOR，誘導(dǎo)mTOR的磷酸化，mTOR在磷酸化后可破壞細(xì)胞的正常生理生化功能，導(dǎo)致炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的過度產(chǎn)生，從而加速組織損害[16-17]。本研究結(jié)果也顯示，與假手術(shù)組比較，各組大鼠血清炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α明顯升高，p-PI3K、p-Akt和p-mTOR明顯降低，而紫檀芪則可明顯升高p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表達，同時降低IL-1β、IL-6、TNF-α的表達，進一步證實紫檀芪對心肌缺血再灌注損傷大鼠炎性因子具有明顯的調(diào)節(jié)作用，其作用機制可能與紫檀芪調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，紫檀芪對心肌缺血再灌注損傷大鼠具有明顯的保護作用，可以減少心肌梗死面積，提高心功能指標(biāo)，其作用機制可能與紫檀芪可以升高PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化，進而降低炎癥反應(yīng)有關(guān)。