小檗堿干預缺血性腦卒中大鼠的作用機制研究

楊魯杰，邢樹禮，司 婕，王雪貞

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)是腦卒中的常見類型，具有發病率高、致殘率高、病死率高、復發率高的特點，且近年來發病率呈上升趨勢，并逐漸低齡化[1]。腦組織對缺氧極為敏感，缺血性腦卒中導致的缺血、缺氧常常會損傷病人認知功能，造成感覺功能、運動神經障礙及精神意識失常。目前，缺血性腦卒中治療以6 h內動、靜脈溶栓及血管介入治療為主，盡管效果明顯，但不適用于時間窗外病人[2]。有研究顯示，治療時間窗短及藥物作用機制單一是治療缺血性腦卒中失敗的主要原因[3]。因此，探究作用機制多樣并具有寬時間窗的藥物對于治療缺血性腦卒中具有重要作用。小檗堿是一種小檗科植物根莖提取的季銨類生物堿，除具有抗炎、抗菌、抗病毒等藥理活性外，對糖尿病、心腦血管疾病、腫瘤等亦有治療效果。既往研究顯示，小檗堿可介導相關信號通路調節缺血性腦卒中小膠質細胞分化，且可通過抑制炎性因子的釋放減輕缺血再灌注損傷，提示其在治療腦血管方面的作用[4-5]。目前，關于小檗堿對缺血性腦卒中認知功能影響的研究較少。本研究通過建立缺血性腦卒中模型大鼠，探究小檗堿對缺血性腦卒中的治療作用，并分析相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 85只無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠，6周齡，體質量(200±20)g，購自北京瑞博開拓醫藥科技有限公司，動物生產許可證號：SYXK(京)2019-0038，自由進食、飲水，環境溫度(24±1) ℃，12 h/12 h明暗交替，適應性飼養1周。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 小檗堿(純度>98%)(成都瑞芬思生物科技有限公司生產)；尼莫地平片(黑龍江天宏藥業股份有限公司生產；國藥準字H20113486；20 mg)。氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液(購自青島海博生物技術有限公司)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒及一氧化氮(nitric oxide，NO)、內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)酶聯免疫吸附法(euzymelinked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購自武漢默沙克生物科技有限公司；三磷酸腺苷(ATP)試劑盒、三氯醋酸均購自北京邁瑞達科技有限公司；脫氧核苷酸轉移酶標記技術(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)購自美國Abcam公司；RIPA細胞裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；5-單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)、脫氧核苷酸轉移酶標注技術(p-AMPK)、沉默信息調節因子2相關酶類1(silent mating type information regulation 2 homolog-1，SIRT1)一抗購自美國Thermo Fisher Scientific公司。Morris水迷宮購自北京友誠嘉業生物科技有限公司；RM2235病理切片機購自徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司；Synergy-HD顯微鏡購自日本Toshiba公司；Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳購自美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立及分組 采用改良Longa線栓法建立缺血性腦卒中大鼠模型[6]。將70只大鼠用2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，剪開左側頸部皮膚，鈍性分離肌群，游離頸總動脈及頸內、外動脈，結扎頸總動脈近心端、頸外動脈，夾閉頸內動脈遠端，距離頸總動脈1 cm位置切小口，將魚線從頸總動脈插入內動脈，直到感受到阻力，深度18～20 mm，線栓即到達并阻塞左側大腦中動脈開口處，扎緊動脈殘端，常規縫合、消毒。大鼠清醒后單籠飼養，采用Longa提出的神經功能評價方法評價其神經功能：無明顯神經功能缺失表現為0分；提尾時左側前肢屈曲且不能伸展為1分；爬行時出現追尾表現或向左側劃圈為2分；爬行困難，向左側傾倒為3分；意識喪失，不能爬行為4分。評分1～3分提示建模成功，0分、4分剔除。剩余15只大鼠將阻塞線插入頸內動脈深度約5 mm，剩余步驟同上，設為健康組。70只大鼠造模成功62只，隨機分為缺血性腦卒中組(15只)、小檗堿低劑量組(15只)、小檗堿高劑量組(16只)、尼莫地平組(16只)。

1.2.2 干預方式 確定建模成功后即根據前期實驗研究結果，結合參考文獻確定小檗堿低劑量組、高劑量組分別以100 mg/kg、200 mg/kg小檗堿與生理鹽水混合后灌胃[7]，每日1次；尼莫地平組采用40 mg/kg尼莫地平片干預，與生理鹽水混合后灌胃，每日1次；健康組與缺血性腦卒中組采用等量生理鹽水灌胃，每日1次。干預時間為14 d。

1.2.3 Morris水迷宮實驗觀察大鼠認知功能 末次干預后次日行Morris水迷宮實驗。水池120 cm×60 cm×25 cm，水溫23 ℃，分為4個象限，第3象限正中放置高23 cm、直徑10 cm的圓形平臺。隨機選取1個象限將大鼠面向池壁放入，記錄大鼠60 s內找到平臺的時間(逃避潛伏期)，超過60 s未找到平臺，記錄潛伏期為60 s，每日訓練2次，每次間隔15 min，共訓練5 d。第6天撤走平臺，將大鼠從原象限的對側放入水中，記錄逃避潛伏期、穿越原平臺次數、目標象限停留時間。

1.2.4 組織取材 水迷宮實驗完成后，頸部斷頭處死大鼠，剪開頭顱，血管鉗去除顱骨，暴露腦組織，取出腦組織后用預冷生理鹽水清除血污，每組取5只大鼠腦組織置于冰上用于TTC染色；10只大鼠去除小腦及枕葉后，取缺血側周圍腦組織，分3份保存于液氮中，1份用于腦組織SOD、NO、eNOS含量檢測，以及Ca2+，Mg2+-ATP酶和Na+，K+-ATP酶活性測定；1份用于HE染色、TUNEL熒光染色；其余用于蛋白免疫印跡法(Western Blot)實驗。

1.2.5 TTC染色法測定腦梗死體積 取冰上保存腦組織，置于-20 ℃冰箱中30 min后取出，沿冠狀面自前腦額部向后連續切片(每片2 mm)，迅速置入含2% TTC的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)溶液中，37 ℃遮光孵育25 min，每5 min輕晃容器，隨后置入4%多聚甲醛中固定12 h，取出腦片后用PBS溶液充分洗滌，拍照后經圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0分析圖像，正常腦組織為鮮紅色，梗死灶為蒼白色。測量每片梗死面積、總面積，梗死體積為層厚與梗死面積乘積，總梗死體積為各層梗死體積之和。

1.2.6 測定腦組織SOD、NO、eNOS含量 取冷凍保存腦組織，稱重后加入生理鹽水，剪刀剪碎，置于預冷玻璃勻漿器中，搗桿充分研磨約5 min，制成10%腦組織勻漿液，3 000 r/min、離心半徑10 cm離心10 min，-80 ℃保存備用。分別采用羥胺法測定腦組織SOD水平，采用ELISA法測定NO、eNOS含量，嚴格按照試劑盒要求設計實驗步驟。

1.2.7 測磷法測定腦組織Ca2+，Mg2+-ATP和Na+，K+-ATP活性 取冷凍保存腦組織，勻漿后以3 000 r/min、離心半徑10 cm離心10 min，取上清定磷，以比色法檢測ATP酶水平。操作步驟為：取勻漿液0.1 mL，加入反應液至1 mL，37 ℃水浴孵育60 min，加入10%三氯醋酸1 mL以終止反應，3 500 r/min、離心半徑10 cm離心5 min，取上清0.5 mL測定腦組織線粒體Ca2+，Mg2+-ATP和Na+，K+-ATP活性。以每小時分解每克組織蛋白產生無機磷的含量表示酶活力單位。

1.2.8 HE染色法觀察腦皮質病理變化 取40%中性甲醛固定的腦組織，脫水、包埋，病理切片機制作成4 μm連續切片，二甲苯脫蠟、乙醇水化，HE染色后觀察腦皮質病理變化。

1.2.9 TUNEL熒光染色法測定海馬區神經元凋亡情況 取40%中性甲醛固定的腦組織，脫水、包埋，病理切片機制作成4 μm連續切片，嚴格按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)說明書要求加入TUNEL反應混合液，濕盒中37 ℃孵育1 min，PBS沖洗，加入過氧化物酶(POD)轉化劑，37 ℃濕盒中繼續孵育30 s，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，加入二氨基聯苯胺(DAB)底物溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗，甘油封片，熒光顯微鏡下計數海馬區凋亡細胞。凋亡率=陽性細胞數/細胞總數×100%。每張切片任選5個視野計數，求平均值。

1.2.10 Western Blot法測定腦組織SIRT1、AMPK、p-AMPK蛋白相對表達量 取冷凍保存腦組織40 mg，研磨后轉至離心管，RIPA細胞裂解液冰上裂解，10 000 r/min，離心半徑10 cm離心20 min，BCA試劑盒測定蛋白濃度，取40 μg待檢測樣本混合5倍體積上樣緩沖液，沸水浴5 min使蛋白變性，10 000 r/min離心半徑10 cm離心20 min，取上清，電泳后濕轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1 000兔抗大鼠SIRT1、AMPK、p-AMPK一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌，加入1∶8 000山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌，暗室中曝光、顯影，凝膠成像系統分析灰度值，以SIRT1、AMPK、p-AMPK灰度值/內參β-actin灰度值表示蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組認知功能比較 與健康組比較，缺血性腦卒中組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組逃避潛伏期延長，穿越原平臺次數減少，目標象限停留時間縮短，差異均有統計學意義(P<0.05)；與缺血性腦卒中組比較，小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組逃避潛伏期縮短，穿越原平臺次數增加，目標象限停留時間延長，差異均有統計學意義(P<0.05)；與小檗堿低劑量組比較，小檗堿高劑量組、尼莫地平組逃避潛伏期縮短，穿越原平臺次數增加，目標象限停留時間延長，差異均有統計學意義(P<0.05)；與小檗堿高劑量組比較，尼莫地平組逃避潛伏期縮短，穿越原平臺次數增加，目標象限停留時間延長，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠認知功能比較(±s)

2.2 各組腦梗死體積比較 缺血性腦卒中組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組腦梗死體積分別為(45.23±5.24)mm3、(37.52±5.02)mm3、(29.65±4.51)mm3、(22.04±4.62)mm3。與缺血性腦卒中組比較，小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組腦梗死體積減小，差異均有統計學意義(P<0.001)；與小檗堿低劑量組比較，小檗堿高劑量組、尼莫地平組腦梗死體積減小，差異均有統計學意義(P<0.001)；與小檗堿高劑量組比較，尼莫地平組腦梗死體積減小，差異有統計學意義(P=0.030)。各組腦梗死體積TTC染色圖詳見圖1。

圖1 各組腦梗死體積TTC染色(A為健康組；B為缺血性腦卒中組；C為小檗堿低劑量組；D為小檗堿高劑量組；E為尼莫地平組)

2.3 各組腦組織SOD、NO、eNOS含量比較 與健康組比較，缺血性腦卒中組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組腦組織SOD含量減少，NO、eNOS含量增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；與缺血性腦卒中組比較，小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組腦組織SOD含量增加，NO、eNOS含量減少，差異均有統計學意義(P<0.05)；與小檗堿低劑量組比較，小檗堿高劑量組、尼莫地平組腦組織SOD含量增加，NO、eNOS含量減少，差異均有統計學意義(P<0.05)；與小檗堿高劑量組比較，尼莫地平組腦組織SOD含量增加，NO、eNOS含量減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組腦組織SOD、NO、eNOS含量比較(±s)

2.4 各組腦組織Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性比較 與健康組比較，缺血性腦卒中組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組腦組織Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與缺血性腦卒中組比較，小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組腦組織Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性增強，差異均有統計學意義(P<0.05)；與小檗堿低劑量組比較，小檗堿高劑量組、尼莫地平組腦組織Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性增強，差異均有統計學意義(P<0.05)；與小檗堿高劑量組比較，尼莫地平組腦組織Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性增強，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組腦組織Na+，K+-ATP酶、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性比較(±s)單位：μmol Pi/mg prot·h

2.5 各組腦組織病理形態學比較 健康組神經元、神經膠質細胞核膜清晰、核仁明顯，無明顯炎性細胞浸潤及神經細胞變性壞死；缺血性腦卒中組神經元結構模糊，胞體腫脹，尼氏體消失，呈現胞核深染、固縮、溶解，核體不規則，并出現軟化灶、炎性細胞浸潤；小檗堿低、高劑量組尼莫地平組干預后神經元胞核深染、固縮、溶解程度有所減輕，軟化灶縮小，炎性細胞浸潤減少，其中尼莫地平組改善最為明顯，其次為小檗堿高劑量組，最后為小檗堿低劑量組。詳見圖2。

圖2 各組腦組織病理形態學觀察(HE染色，×400，標尺50 μm)

2.6 各組海馬區神經元凋亡率比較 健康組、缺血性腦卒中組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組海馬區神經元凋亡率分別為(1.25±0.32)%、(71.52±9.27)%、(50.98±6.88)%、(33.85±4.02)%、(19.96±3.14)%。與健康組比較，缺血性腦卒中組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組海馬區神經元凋亡率均降低，差異均有統計學意義(P<0.001)；與缺血性腦卒中組比較，小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組海馬區神經元凋亡率均降低，差異均有統計學意義(P<0.001)；與小檗堿低劑量組比較，小檗堿高劑量組、尼莫地平組海馬區神經元凋亡率均降低，差異均有統計學意義(P<0.001)；與小檗堿高劑量組比較，尼莫地平組海馬區神經元凋亡率降低，差異有統計學意義(P<0.001)。詳見圖3。

圖3 海馬區神經元凋亡TUNEL熒光染色(×100)

2.7 各組腦組織SIRT1蛋白相對表達量、p-AMPK/AMPK比較 與健康組比較，缺血性腦卒中組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組SIRT1蛋白相對表達量、p-AMPK/AMPK均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與缺血性腦卒中組比較，小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組SIRT1蛋白相對表達量、p-AMPK/AMPK均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與小檗堿低劑量組比較，小檗堿高劑量組、尼莫地平組SIRT1蛋白相對表達量、p-AMPK/AMPK均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與小檗堿高劑量組比較，尼莫地平組SIRT1蛋白相對表達量、p-AMPK/AMPK均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表4、圖4。

表4 各組腦組織SIRT1蛋白相對表達量、p-AMPK/AMPK比較(±s)

圖4 腦組織SIRT1、AMPK、p-AMPK蛋白表達條帶圖(A為健康組；B為缺血性腦卒中組；C為小檗堿低劑量組；D為小檗堿高劑量組；E為尼莫地平組)

3 討 論

缺血性腦卒中是腦動脈短暫或持續性閉塞所致的腦供血不足，進而引發一系列級聯反應，最終導致缺血區域腦組織發生不可逆損傷[8]。目前，臨床關于缺血性腦卒中發病機制通常被認為與腦細胞能量耗竭、腦組織酸中毒、神經毒素毒性作用、海馬神經元凋亡、梗死灶周圍半暗帶去極化、炎性細胞因子及氧自由基損傷有關[9-10]。認知功能異常是缺血性腦卒中后高發神經心理學表現，且是影響病人日常生活及各項功能的重要因素。因此，探究促進缺血性腦卒中后認知功能改善的有效方式，并分析相關分子機制具有廣闊前景。

研究顯示，能量衰竭是導致腦卒中后腦組織損傷最直接的原因[11]。缺血性腦卒中后經氧自由基等途徑導致線粒體結構及功能異常，誘發能量衰竭，進而造成神經元凋亡或壞死數量增加。本研究結果顯示，缺血性腦卒中組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、尼莫地平組大鼠逃避潛伏期依次縮短、穿越原平臺次數依次增加、目標象限停留時間依次延長、腦組織SOD含量依次增加，NO、eNOS含量依次減少，腦組織線粒體Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性依次增強，梗死體積依次縮小，腦皮質病理變化依次減輕，海馬神經元凋亡率依次降低，提示小檗堿可改善缺血性腦卒中認知功能、氧化應激、能量代謝、病理損傷，縮小梗死體積，減少海馬神經元凋亡，且呈劑量依賴性。小檗堿是多種具有清熱解毒功效中藥的共有成分，以往常用于痢疾、細菌性腸胃炎等消化道疾病的治療。近年來研究發現，小檗堿可經多種途徑發揮腦缺血的保護作用[12]。Yang等[13]研究報道，小檗堿可通過激活相關信號通路，降低凋亡蛋白表達緩解光化學法誘導的腦缺血/再灌注損傷。Martins等[14]在體外肝移植動物模型的保存溶液中加入小檗堿可保護線粒體功能和生物能，使其免受缺血/再灌注傷害，提示小檗堿對線粒體功能有保護作用。Maleki等[15]在大鼠局灶性腦缺血后1 h采用小檗堿處理，通過行為測試及含水量測定發現小檗堿可顯著改善腦水腫，并有助于運動功能的恢復，證實其治療缺血性腦卒中的有效性，本研究結果與其具有部分相似性。

SIRT1是一種對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸具有依賴性的去乙酰化酶，通過使非組蛋白及組蛋白發生乙酰化作用進而參與細胞生物學行為及能量代謝等過程。AMPK是一種具有高度保守性的蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，通過影響細胞物質代謝途徑促進脂肪酸氧化及ATP生成，以維持細胞能量平衡，通常作為“能量調節器”“細胞內燃料機”備受關注。既往研究顯示，缺血性腦卒中后神經及認知功能損傷主要是能量供應不足所致，SIRT1可通過調控煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水平來調節AMPK表達，增加糖酵解，抑制糖異生，增加神經細胞能量供應，且磷酸化AMPK通過激活自噬、抑制炎癥反應及氧化應激、減少細胞凋亡、促血管新生等途徑，減輕缺血性腦卒中后神經功能損傷[16]。董海平等[17]研究證實，激活AMPK/SIRT1通路對大鼠腦缺血再灌注損傷具有抑制作用，且通過降低炎性因子水平發揮神經保護作用。本研究結果顯示，缺血性腦卒中組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組SIRT1蛋白相對表達量、p-AMPK/AMPK依次增加，提示小檗堿對缺血性腦卒中的改善作用可能是通過激活AMPK信號通路來實現的。

綜上所述，小檗堿可改善缺血性腦卒中大鼠認知功能、縮小梗死體積、減輕氧化應激及腦組織病理變化，改善腦組織能量代謝，減少海馬神經元凋亡，推測其作用機制與激活AMPK信號通路有關。