心房顫動(dòng)病人血漿長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19表達(dá)與心肌重構(gòu)的相關(guān)性分析

羅赤峰，姚 焰，何 丹，馬 敏，彭 靜，陳遠(yuǎn)剛

心房顫動(dòng)是臨床上較常見的一種持續(xù)性心律失常病癥類型，其主要臨床特征為心房高頻率興奮，進(jìn)而引起心房收縮表現(xiàn)不同步及心室興奮表現(xiàn)不規(guī)則等。該疾病具有發(fā)病率高、病情復(fù)雜、難治愈等特點(diǎn)[1-3]。據(jù)有關(guān)報(bào)道顯示，近年來(lái)心房顫動(dòng)發(fā)病率逐年升高，且到目前為止全球范圍內(nèi)有近4 000萬(wàn)人患有心房顫動(dòng)，嚴(yán)重危害病人的身心健康并影響病人正常生活。長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19(long non-coding RNA H19，LncRNA H19)是一種自身不編碼蛋白的長(zhǎng)鏈RNA分子，可以通過(guò)調(diào)節(jié)核糖的方式控制人體基因的表達(dá)[4-5]。相關(guān)研究證實(shí)，LncRNA H19在腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[6-7]。心肌重構(gòu)是心肌對(duì)長(zhǎng)期血管壓力或容量負(fù)荷過(guò)重等刺激的適應(yīng)性變化，也是許多心血管疾病的最后通路[8]。有研究顯示，心力衰竭和病理性心肌肥厚病人LncRNA H19表達(dá)升高，進(jìn)而影響心肌纖維化過(guò)程[9]。目前，血漿LncRNA H19與心房顫動(dòng)的發(fā)病機(jī)制及其與心肌重構(gòu)的關(guān)系尚不完全清楚。基于此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)心房顫動(dòng)病人血漿LncRNA H19的表達(dá)情況，并探討其表達(dá)水平與心房顫動(dòng)病人心肌重構(gòu)的關(guān)系，以期為臨床診斷及治療心肌重構(gòu)提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月—2019年2月在本院心內(nèi)科確診并住院治療的心房顫動(dòng)病人112例為心房顫動(dòng)組，其中男69例，女43例，年齡45～68(59.03±3.24)歲。選取同期在本院進(jìn)行常規(guī)體檢未患有心房顫動(dòng)的人群107名為對(duì)照組，其中男60名，女47名，年齡43～69(58.79±3.11)歲。心房顫動(dòng)組及對(duì)照組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)及吸煙占比比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而心房顫動(dòng)組糖尿病及高血壓占比明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。詳見表1。該研究經(jīng)本院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有樣品采集病人及家屬知情并簽署同意書，且符合世界醫(yī)學(xué)大會(huì)《赫爾辛基宣言》。

表1 兩組一般資料比較

1.2 心房顫動(dòng)組納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合《心房顫動(dòng)病人管理指南》中制定的心房顫動(dòng)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；②入院前2個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)相關(guān)藥物進(jìn)行治療者；③病人及家屬選擇在本院接受治療者；④臨床資料齊全者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①同時(shí)患有心律失常等疾病者；②同時(shí)患有嚴(yán)重自身免疫疾病者；③臨床資料不全者。

1.4 主要試劑與儀器 總RNA提取試劑盒(貨號(hào)：20310)，購(gòu)自北京甘棠飛華生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：AORT-0020)，購(gòu)自上海伯易生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)：StepOne TM)，購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；LncRNA H19及內(nèi)參GAPDH引物，由上海杏園瑞民生物工程有限公司合成；彩色多普勒超聲心動(dòng)圖儀(型號(hào)：Sonos-1000)，購(gòu)自美國(guó)HP公司；其他大部分化學(xué)藥品均購(gòu)自上海康鵬科技股份有限公司。

1.5 研究方法

1.5.1 樣品采集及保存 于清晨抽取所有研究對(duì)象空腹靜脈血5 mL，放入枸櫞酸鈉抗凝試管中，3 000 r/min離心10 min后收集血漿，并置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 血漿LncRNA H19表達(dá)水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)血漿LncRNA H19水平。取待測(cè)血漿，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系共10 μL，上下游引物各0.2 μL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的反應(yīng)條件為：95 ℃，2 min；95 ℃，25 s；60 ℃，30 s；72 ℃，20 s。共40個(gè)循環(huán)。血漿LncRNA H19及內(nèi)參GAPDH的上下游引物序列見表2。采用2-△△CT法計(jì)算血漿LncRNA H19相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次取平均值。

表2 引物序列

1.5.3 心肌重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 應(yīng)用探頭頻率為2～4 MHz的彩色多普勒超聲心動(dòng)圖儀對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行超聲檢查，測(cè)定病人的左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fractions，LVEF)、左房?jī)?nèi)徑(left atrium diameter，LAD)、右房?jī)?nèi)徑(right atrium diameter，RAD)水平，并根據(jù)公式計(jì)算左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血漿LncRNA H19表達(dá)水平比較 心房顫動(dòng)組血漿LncRNA H19表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組血漿LncRNA H19表達(dá)水平比較(±s)

2.2 兩組心肌重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)比較 心房顫動(dòng)組LVMI、LAD及RAD水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，LVEF水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。詳見表4。

表4 兩組心肌重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)比較(±s)

2.3 血漿LncRNA H19與心肌重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析 Pearson法分析結(jié)果顯示，心房顫動(dòng)病人血漿LncRNA H19表達(dá)水平與LVMI及LAD表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.483，P<0.05；r=0.496，P<0.05)，與LVEF表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.507，P<0.05)，與RAD表達(dá)水平無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.147，P>0.05)。詳見圖1～圖3。

圖1 心房顫動(dòng)病人血漿LncRNA H19與LVEF的相關(guān)性分析

圖2 心房顫動(dòng)病人血漿LncRNA H19與LVMI的相關(guān)性分析

圖3 心房顫動(dòng)病人血漿LncRNA H19與LAD的相關(guān)性分析

2.4 心房顫動(dòng)發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析 以心房顫動(dòng)疾病發(fā)生為因變量(否=0，是=1)，血漿LncRNA H19、LVEF、LVMI及LAD為自變量，采用Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：血漿LncRNA H19、LVMI及LAD水平高是心房顫動(dòng)發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，LVEF水平高為心房顫動(dòng)發(fā)生的保護(hù)性因素。詳見表5。

表5 心房顫動(dòng)發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析

3 討 論

心房顫動(dòng)是一種臨床較常見的頑固性心臟類疾病。病人常表現(xiàn)為持續(xù)性或長(zhǎng)期陣發(fā)性心律失常，主要因心房的不規(guī)則且快速激活，從而引起不協(xié)調(diào)收縮。心房顫動(dòng)發(fā)病時(shí)常導(dǎo)致體內(nèi)血流瘀滯、血管出現(xiàn)高凝狀態(tài)等，易造成心房形成血栓，最終出現(xiàn)腦卒中、心肌梗死等心血管并發(fā)癥[11-13]。流行病學(xué)研究顯示，我國(guó)心房顫動(dòng)的發(fā)生率約為1%，且隨著人口老齡化的加劇呈逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響人們的健康及生活質(zhì)量，且給病人家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而，目前對(duì)心房顫動(dòng)的病因及具體的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，因此，對(duì)其發(fā)病理機(jī)制進(jìn)行深入研究，以尋找新的疾病標(biāo)志物并研究其與心肌重構(gòu)的關(guān)系具有重要的臨床意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs，LncRNAs)是一類不具有蛋白質(zhì)編碼功能且長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的RNA分子，其基因在人類基因組中約占98%。大量研究表明，LncRNAs在生物體內(nèi)具有非常廣泛的生物學(xué)功能，參與多種生物學(xué)機(jī)制，可通過(guò)某些特定方式控制基因的表達(dá)，并在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[14]。有研究證實(shí)，LncRNAs在心臟及心血管疾病中發(fā)揮重要作用。LncRNA H19是人類最早被鑒定的一種印跡基因，長(zhǎng)度為2.3 kb，位于人類染色體11p15.5上。研究表明，LncRNA H19與心血管等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[15]。張博方等[16]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19在多種心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展中起著重要作用，其可能作為心血管疾病治療的新靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，心房顫動(dòng)組血漿LncRNA H19表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，提示血漿LncRNA H19可能參與心房顫動(dòng)的發(fā)展進(jìn)程。

心肌重構(gòu)即心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，主要作用包括心肌細(xì)胞重構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)兩個(gè)部分。其主要作用是維持心臟的結(jié)構(gòu)、完整性及其機(jī)械特性。心肌重構(gòu)的主要特點(diǎn)是膠原細(xì)胞異常增加、心肌肥大及電生理發(fā)生改變等[17]。研究顯示，提高動(dòng)物體內(nèi)LncRNA H19表達(dá)水平，可促使體內(nèi)自噬基因-7表達(dá)，進(jìn)而激活自噬機(jī)制，以達(dá)到保護(hù)心肌的作用，減少心肌梗死面積并增強(qiáng)心功能[16]。本研究結(jié)果顯示，心房顫動(dòng)組LVMI、LAD及RAD水平明顯高于對(duì)照組， LVEF值明顯低于對(duì)照組，提示心房顫動(dòng)病人心肌發(fā)生重構(gòu)。心房顫動(dòng)病人血漿LncRNA H19表達(dá)水平與LVMI及LAD呈正相關(guān)，與LVEF表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。此外，Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血漿LncRNA H19、LVMI及LAD水平高是影響心房顫動(dòng)疾病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)血漿LncRNA H19表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)可為疾病評(píng)估提供更充分的臨床依據(jù)。

綜上所述，LncRNA H19在心房顫動(dòng)病人血漿中的表達(dá)水平明顯升高，且與心肌重構(gòu)密切相關(guān)，提示血漿LncRNA H19可作為心房顫動(dòng)病情評(píng)估的潛在生物學(xué)指標(biāo)。但本研究因納入例數(shù)偏少可能影響結(jié)果，存在一定偏移，為提高研究精確性，后期應(yīng)在大量樣本基礎(chǔ)上進(jìn)行深入探究。