針刺聯合重復經顱磁刺激療法治療帕金森病的療效及對miR-103a、miR-214表達的影響

侯鑫磊，唐 強，朱路文，李宏玉，宋 琦，王丹丹

帕金森病為一種神經系統變性疾病，其首發癥狀為靜止性震顫，主要表現為姿勢異常、運動遲緩、僵直等，多數病人伴隨著抑郁、認知功能損害、睡眠障礙、運動受限以及便秘等[1]。研究顯示，隨著年齡的增加，帕金森病的發生率隨之升高。目前，我國老齡化較為嚴重，導致帕金森病的發生率呈現逐年上升的趨勢[2-3]。目前帕金森病的治療多以藥物治療為主，多數病人需要長期使用左旋多巴等藥物，但長期使用會給病人帶來不同程度的毒副作用，不利于疾病的恢復[4-5]。因此，尋找合理有效的治療帕金森病的手段，對促進疾病的恢復具有重要的意義。本研究探討針灸聯合重復經顱磁刺激療法治療帕金森的效果，以期為臨床治療提供新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年8月—2020年8月黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院收治的帕金森病病人156例為研究對象，按照隨機數字表法分為磁刺激組、聯合組，每組78例。磁刺激組，男42例，女36例；年齡52～70(61.78±3.76)歲；病程(4.78±1.29)年。聯合組，男43例，女35例，年齡56～80(62.39±2.35)歲；病程(4.70±1.22)年。兩組病人性別、年齡、病程、基礎疾病等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準，所有病人及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：符合《帕金森病抑郁中西醫結合診斷與治療專家共識》中帕金森病的相關診斷標準[6]；未使用臨床手段治療、無治療禁忌證、意識清楚者。排除標準：有特發性震顫或其他影響神經系統的疾病；溝通障礙者；嚴重癡呆者；合并癲癇等精神疾病者；合并自身免疫性疾病者；合并嚴重的心腦血管疾病者；有顱腦損傷、腦血管意外等疾病史；合并心、肝、腎等多臟器功能不全者。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 參照2014年《中國帕金森病治療指南(第三版)》[7]，兩組病人均行常規治療。磁刺激組采用重復經顱磁刺激療法治療，采用丹麥Dantec公司生產的磁刺激器Magpro100及8字形線圈行重復經顱磁刺激治療，最大磁場強度4.2 T，單圈外徑為70 mm，刺激部位在左前額葉背外側，開始強度在90%～100%，刺激頻率為0.5 Hz，每串刺激300 s，間歇30 s，刺激750次，每周2次，連續治療8周。聯合組采用針灸聯合重復經顱磁刺激療法，重復經顱磁刺激療法同磁刺激組。針灸：取“顱底七穴”，即啞門、雙側風池、雙側完骨、雙側天柱，使用2寸不銹鋼毫針。從啞門垂直進針，向下頜或者鼻尖方向緩慢刺入，刺入1.5寸，并在1.0～1.5寸范圍內提插9次，在此過程中注意進針深度，避免刺入硬膜；風池穴垂直進針，向對側鼻尖刺入1.2寸；完骨穴垂直進針，向鼻尖方向刺入1寸；天柱穴垂直進針，向鼻尖或下頜方向刺入1寸。均以捻轉手法，頻率為120次/min，平補平瀉，持續2 min，留針30 min。每日1次，連續治療8周。

1.3.2 P300潛伏期、波幅檢測 治療前、治療后1 d，兩組病人均行實施事件相關電位(ERP)P300檢查，使用美國美敦力公司所提供的4通道全功能肌電圖誘發電位儀檢測靶刺激下P300潛伏期、波幅。

1.3.3 腦神經遞質5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺(NE)、多巴胺(DA)、同型半胱氨酸(Hcy)、胱抑素C(CysC)水平檢測 采用酶聯免疫吸附試驗法(ELISA法)檢測5-HT、NE、DA、Hcy、CysC水平，采集病人治療前、治療后清晨空腹靜脈血3 mL，分離血清，將所制備的上清液置于室溫后，取出試劑盒，標記酶標板，制作標準品，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應孔上依次加入四甲基聯苯胺稀釋好的待測血清及標準品每孔100 μL，放置37 ℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用專用洗滌液將反應板清洗3次后，加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)每孔100 μL，置于37 ℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續清洗反應板4次后，在反應孔內加入四甲基聯苯胺(TMB)溶液每孔100 μL，置于37 ℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應孔內加入終止液每孔100 μL以終止反應，檢測5-HT、NE、DA、Hcy、CysC水平。

1.3.4 微小RNA-103a(miR-103a)、微小RNA-214(miR-214)表達量檢測 采集病人治療前、治療后1 d清晨空腹外周靜脈血3 mL，分離出單個核細胞，采用熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測血miR-103a、miR-214表達量，利用Trizol法提取單個核細胞總RNA，使用紫外分光光度儀對所提取的RNA純度進行檢測，總RNA純度鑒定運用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。利用miR CURY LNA Universal RT microRNA聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒合成cDNA。逆轉錄：14 μL模板RNA、2 μL Enzyme mix，4 μL 5×RT緩沖液，補至20 μL，在PCR檢測儀上42 ℃ 1 h、95 ℃ 5 min，之后將所合成的cDNA放置于溫度為-20 ℃環境下進行保存。反應體系：8 μL cDNA模板、10 μL SYBRP Green mix、2 μL PCR Primer mix。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 1 min；40個循環。以β-actin為內參，采用2-△△Ct方法計算所有研究對象miR-103a、miR-214表達量。

1.3.5 認知功能評分、生活質量評分、中醫證候積分評價 采用簡易智力狀態評分(MMSE)量表評價病人認知功能，包括地點定向力、時間定力等，該檢測表總分50分，分數越低說明病人認知能力障礙越嚴重。采用統一帕金森病評定量表(UPDRS)進行生活質量評分，該評分包括UPDRS-Ⅰ(精神行為情緒)、UPDRS-Ⅱ(部分日常生活活動)、UPDRS-Ⅲ(部分運動)3個分量表，分值越高說明病人疾病表現越嚴重。參照《中醫老年顫證診斷和療效評定標準》對病人中醫證候進行評價，包括肢體或者頭部顫振、智力減退、頸部僵直、肢體拘緊、活動笨拙、少動、失憶、耳鳴、頭暈頭痛等，根據輕重程度計0～3分，分數越高說明病人癥狀越嚴重[8]。

1.3.6 臨床療效評價 根據UPDRS對病人臨床療效進行評價，分為顯效、有效、無效3個等級，顯效：病人治療后臨床癥狀完全消失，UPDRS減分率≥46%；有效：病人治療后臨床癥狀明顯改善，UPDRS減分率在15%～45%；無效：病人治療后臨床癥狀未改善，且有加重的趨勢，UPDRS減分率<15%。治療總有效率=顯效率+有效率，UPDRS減分率=(治療前評分-治療后評分)/治療前評分×100%[9]。

2 結 果

2.1 兩組P300潛伏期、波幅比較 治療前，兩組P300潛伏期、波幅比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；治療后，兩組P300潛伏期降低，波幅升高，且聯合組P300潛伏期低于磁刺激組，波幅高于磁刺激組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組P300潛伏期、波幅比較(±s)

2.2 兩組血清腦神經遞質5-HT、NE、DA水平比較 治療前，兩組5-HT、NE、DA水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；治療后，兩組5-HT、NE、DA水平均較治療前升高，且聯合組5-HT、NE、DA水平高于磁刺激組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組血清腦神經遞質5-HT、NE、DA水平比較(±s)

2.3 兩組Hcy、CysC水平比較 治療前，兩組Hcy、CysC水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；治療后，兩組Hcy、CysC水平均較治療前降低，且聯合組Hcy、CysC水平低于磁刺激組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組病人Hcy、CysC水平比較(±s)

2.4 兩組miR-103a、miR-214表達量比較 治療前，兩組miR-103a、miR-214表達量比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；治療后，兩組miR-103a、miR-214表達量均較治療前降低，且聯合組miR-103a、miR-214表達量低于磁刺激組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 兩組miR-103a、miR-214表達量比較(±s)

2.5 兩組MMSE評分、UPDRS評分、中醫證候積分比較 治療前，兩組MMSE評分、UPDRSⅠ-Ⅲ評分、中醫證候積分比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；治療后，兩組MMSE評分較治療前升高，UPDRSⅠ-Ⅲ評分、中醫證候積分較治療前降低，且聯合組MMSE評分高于磁刺激組，UPDRSⅠ-Ⅲ評分、中醫證候積分低于磁刺激組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表5。

表5 兩組MMSE評分、UPDRS評分、中醫證候積分比較(±s)單位：分

2.6 兩組臨床療效比較 與磁刺激組比較，聯合組的總有效率較高，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表6。

表6 兩組臨床療效比較

3 討 論

帕金森為一種以肌肉僵直、靜止性震顫、運動減少為主要特征的慢性中樞神經系統神經退行性疾病。重復經顱磁刺激療法可經刺激病人病灶部位，利用脈沖磁場作用于腦組織，誘發一定強度的感生電流，使得神經細胞去極化，進而誘發電位，調節病人大腦皮層的興奮性，促進疾病恢復，是一種耐受性良好、非侵入性的治療手段[10-11]。臨床研究顯示，在重復經顱磁刺激的作用下，特殊的波形可直接刺激病人下丘腦、大腦，促使其釋放5-HT、NE、DA等神經遞質，改善神經病變，修復神經損傷[12-13]。但隨著重復經顱磁刺激療法的應用，發現單純應用此種療法效果不理想[14]。中醫學上認為帕金森屬于“震顫”“顫證”“肝風”等范疇，認為此病的病位在腦，與肝、腎密切相關，針灸是中醫常用的治療手段，針對病人疾病特征選取特定的穴位進行針灸治療，可改善疾病癥狀[15]。本研究選擇顱底七穴聯合應用針刺、重復經顱磁刺激療法對帕金森病病人進行治療。顱底七穴分布在督脈、足太陽膀胱經、足少陽膽經，均屬于陽經，分布于頭顱底部，順次排開，七穴相連，共同形成了帕金森病的顱底治療帶，較易直達病所，結果發現，病人腦波明顯改善，且神經遞質含量明顯增加，提示兩者共同刺激病灶，促進神經遞質的分泌、修復損傷。

Hcy是一種蛋氨酸代謝產物，與機體的能量代謝有關，參與神經變性疾病的發生發展，在帕金森病病人中異常升高，表明病人機體能量代謝處于失衡狀態[16]。CysC是神經系統疾病診治的敏感指標，帕金森病發生后其含量增高[17]。本研究發現，聯合治療組采用針灸、重復經顱磁刺激療法，Hcy、CysC水平均明顯降低，表明兩者聯合治療帕金森有效。miRNA是一類位于人類19～23號染色體上的非編碼RNA，可特異性結合mRNA分子3′端非編碼區域序列，抑制靶mRNA翻譯和降解靶mRNA，參與神經系統疾病的發生，參與細胞增殖、凋亡、分化等過程，與心血管疾病、神經系統疾病、惡性腫瘤的發生相關[18]。另外，研究顯示，在神經組織中所表達的miRNA具有明顯的組織特異性，當其過度表達或者缺失時，會導致相應神經退行性疾病的發生，并促進疾病進展[19]。臨床研究發現，帕金森病的發生與α-synuclein異常聚集所致的多巴胺神經元凋亡相關，而miR-214參與α-synuclein異常聚集過程，miR-214在帕金森病中處于較高水平[20-21]。miR-103a以GRCh38 p12為前體，經一系列的加工修飾而形成，參與多種神經中樞疾病的發生，包括精神分裂癥、帕金森病等，在上述病人機體內含量明顯升高[22]。本研究結果發現，針刺、重復經顱磁刺激療法可明顯抑制miR-214、miR-103a異常表達，提示兩者聯合具有抑制多巴胺神經元凋亡、抑制中樞神經病變進展的作用。

研究指出，帕金森病的發生和發展與線粒體的功能缺陷、泛酸蛋白酶體功能異常、氧化應激、遺傳因素、環境因素、年齡因素等密切相關[23]。該疾病的發生會造成病人出現運動遲緩、僵直、認知功能損害、運動受限以及便秘等癥狀，治療過程中則需要平衡病人泛酸蛋白酶體功能，以及腦內多巴胺的補充。本研究結果表明，針刺聯合重復經顱磁刺激可使病人智力狀態、生活質量等中醫證候積分顯著降低，可能與該聯合方案能有效改善病人頭部震顫、智力減退、頸部僵直、頭暈頭痛等癥狀有關。

綜上所述，針刺聯合重復經顱磁刺激療法可明顯改善帕金森病病人臨床癥狀，改善miR-103a、miR-214異常表達，促進腦神經遞質分泌。