基于代謝組學技術探討水合氯醛致大鼠血生化變化的機制研究*

胡艷輝 陳敏健 周 昆 秦 珩 環 飛 章 婉 張靜姝 王玉邦

1 南京醫科大學附屬逸夫醫院，江蘇省南京市 211100； 2 南京醫科大學公共衛生學院衛生毒理學系；3 南京醫科大學公共衛生學院全球健康中心； 4 南京醫科大學公共衛生學院流行病學系； 5 江蘇省醫藥農藥獸藥安全性評價中心

水合三氯乙醛(水合氯醛)是乙醇氯化合成的一種化學物，它主要作為一種麻醉藥、催眠藥和抗驚厥藥用于動物實驗研究和臨床用藥中。雖然此種藥物并未得到美國FDA和歐盟的認證，且存在一定的臨床風險，但是依然具有一定的市場。 其使用范圍主要包括：實驗動物(大鼠、小鼠等)、成人、兒童等，由此可見水合氯醛的使用范圍相當廣泛。水合氯醛作為常規麻醉藥在動物實驗中經常被使用，會引起一些生化指標的變化，這些生化指標改變與其對人類健康以及對動物實驗學結果的科學性具有重要意義。而其背后的機制尚不清楚，局限了對水合氯醛不良效應的評估、預防和治療措施的制定。

代謝組學是比基因組學、轉錄組學和蛋白組學更接近表型的一門新興組學。目前的研究數量雖然少于其他組學，但是它的發展很快。代謝組學主要對生物體內的所有代謝物進行定量分析，研究的對象主要是相對分子質量<1 000的小分子物質。這些內源性小分子代謝物主要涉及以下代謝途徑：能量代謝、糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝、輔酶代謝、核酸代謝等。近年來，代謝組學已經被用于從代謝組學角度探索化學物毒性和疾病發生，這也提示代謝組學研究適合用于水合氯醛潛在毒性效應的研究。

肝臟為機體整體代謝的關鍵臟器；血液反映機體的整體循環代謝狀態；胰腺與生化的血糖指標關系密切。本研究采用代謝組學的技術整合動物模型來探討水合氯醛麻醉藥使用對機體血生化的影響，并采用高度相關的代謝組學技術分析肝臟、血清胰腺探討分子機制，為其不良效應的評估、預防和治療措施的制定提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7周齡SD雄性大鼠27只，體重200～300g，由上海西普爾—必凱實驗動物有限公司提供。實驗動物生產許可證號:SCXK(滬)2013-0016，動物飼養于南京醫科大學衛生分析檢測中心屏障系統[實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2015-0009]，溫度20～26℃，濕度40%～70%。按照實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要儀器與試劑 UPLC Ultimate 3000 system(Dionex)超高效液相色譜儀、Q-Exactive三重四極桿串聯質譜儀、日立7100型全自動血生化儀器、TraceFinder 3.1軟件(Thermo Fisher Scientific)、電子天平(MettlerAE240型、T1000型)、KQ3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、XW-80A漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)、離心濃縮干燥儀(Labconco，USA)等。

水合氯醛(中國藥品生物制品檢定所，批號:100121-199903)、生理鹽水(安徽雙鶴藥業有限責任公司)、胰高血糖素試劑盒(北京北方生物技術研究所)、胰島素試劑盒(北京北方生物技術研究所)、甲醇、乙腈(≥99.9%，Merck，German)、甲酸(≥98.0%，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)、超純水(PURELAB Ultra純水儀，英國ELGA公司)等。

1.3 方法 7周齡雄性SD大鼠 27 只，置于代謝籠飼養，適應性喂養1周后，隨機分為溶劑對照組、5%水合氯醛腹腔注射組、10%水合氯醛腹腔注射組，每組9只。溶劑對照組大鼠采用頸椎脫臼方式直接進行腹主動脈采血，5%水合氯醛腹腔注射麻醉10min后進行腹主動脈采血，10%水合氯醛腹腔注射麻醉5min后進行腹主動脈采血。采血前禁食16h。全自動血生化儀器檢測血清中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、血糖、甘油三酯、總蛋白、白蛋白、尿素氮的變化。胰高血糖素和胰島素試劑盒檢測胰高血糖素和胰島素的水平。UPLC-QE代謝組分析平臺檢測血清、胰腺、肝臟代謝譜的變化。

1.4 代謝組學分析

1.4.1 血清前處理。取血清10μl，按甲醇相∶水相=3∶1沉淀蛋白，渦旋30s，冷凍離心機中4℃16 000g離心15min，將上清液轉移至1.5ml進口EP管，并將上清液在室溫條件下于離心濃縮干燥儀(Labconco，USA)中濃縮至干，復溶，待分析。

1.4.2 肝臟、胰腺組織前處理。取組織50mg加入750μl超純水進行稀釋，然后用解剖用剪刀剪碎進行超聲勻漿(功率=30%，每超聲3s間隔1s，EP管置于冰上)，取混合液150μl，按甲醇相∶水相=3∶1沉淀蛋白，冷凍離心機中4℃ 20 000g 離心15min，將上清液轉移至1.5ml進口EP管，并將上清液在室溫條件下于離心濃縮干燥儀(Labconco，USA)中濃縮至干，復溶，待分析。

1.4.3 超高效液相色譜串聯質譜分析。(1)色譜條件：采用 Hypersil GOLD C18色譜柱 (100mm×2.1mm，粒徑1.9μm Thermo Scientific，Germany)，流動相A乙腈(含0.1%甲酸)，流動相B超純水(含0.1%甲酸)，流速0.40ml/min。采用梯度洗脫的方式，柱溫：40℃，進樣量：5μl，流動相梯度變化為：0.00～3.00min范圍，流動相A為1.0%；3.00～10.00min范圍，流動相A為1.0%～99.0%；10.00～13.00min范圍，流動相A為99.0%～99.0%；13.00～13.10min范圍，流動相A為99.0%～1.0%；13.10～15.00min范圍，流動相A為1.0%。(2)質譜條件：代謝物標準品庫建立和樣本實際檢測之前，分別采用正負離子校正液對質譜儀質量數進行24h內定期校正。采用加熱電噴霧電離方式(HESI)，正負離子模式噴霧電壓分別為3.5kV和2.5kV，兩種模式下加熱器溫度為425℃，毛細管溫度為250℃，輔助氣氣流為13AU，鞘氣氣流為50AU，反吹氣氣流為0AU，透鏡電壓為60V。采用全掃模式進行掃描，掃描范圍：70～1 050m/z，分辨率為70 000。

1.5 物質定性分析 采用TraceFinder 3.1軟件(Thermo Fisher Scientific)，對代謝物進行定性，以相對定量進行統計分析。

2 結果

2.1 5%、10%水合氯醛腹腔注射后血清生化指標、胰高血糖素和胰島素的變化 如表1所示，與對照組比較，5%、10%水合氯醛腹腔注射后血糖水平呈現明顯上升；膽固醇、甘油三酯、總蛋白、白蛋白、谷草轉氨酶水平呈現不同程度的下降；尿素氮、谷丙轉氨酶和肌酐水平并未發生變化；胰高血糖素和胰島素水平也未發生變化。

表1 不同濃度水合氯醛腹腔注射后對SD大鼠血生化指標、胰高血糖素和胰島素的影響

2.2 血清代謝譜變化 共檢測到123個血液代謝物，刪除檢出率<15%的化學物后，最終留下96個代謝物進行分析。對所有QC樣本分析后發現，所有化學物的RSD均<30%，說明分析具有較好的穩定性和可靠性。這些化學物17個分布在氨基酸代謝，16個分布在脂質代謝，12個分布在碳水化合物代謝，10個分布在核酸代謝，7個分布在維生素和輔酶代謝，1個分布在內分泌代謝，3個分布在其他氨基酸代謝，2個分布在外來物質的降解和代謝，2個分布在消化系統代謝，26個分布在其他代謝(圖1)。

圖1 血清樣本篩選的代謝物所在代謝通路分布圖

2.3 肝臟代謝譜變化 共檢測到183個肝臟代謝物，刪除檢出率<15%的化學物后，最終留下133個代謝差異物進行分析。對所有QC樣本分析后發現，所有化學物的RSD均<30%，說明分析具有較好的穩定性和可靠性。這些化學物27個分布在氨基酸代謝，19個分布在脂質代謝，15個分布在碳水化合物代謝，16個分布在核酸代謝，13個分布在維生素和輔酶代謝，1個分布在內分泌代謝，4個分布在其他氨基酸代謝，2個分布在外來物質的降解和代謝，2個分布在消化系統代謝，1個分布在運輸和代謝，33個分布在其他代謝(圖2)。

圖2 肝臟樣本篩選的代謝物所在代謝通路分布圖

2.4 胰腺代謝譜變化 共檢測到157個胰腺代謝物，刪除檢出率<15%的化學物后，最終留下129個代謝物進行分析。對所有QC樣本分析后發現，所有化學物的RSD均<30%，說明分析具有較好的穩定性和可靠性。這些化學物27個分布在氨基酸代謝，18個分布在脂質代謝，14個分布在碳水化合物代謝，16個分布在核酸代謝，9個分布在維生素和輔酶代謝，1個分布在內分泌代謝，3個分布在其他氨基酸代謝，4個分布在外來物質的降解和代謝，1個分布在運輸和代謝，2個分布在消化系統代謝，34個分布在其他代謝(圖3)。

圖3 胰腺樣本篩選的代謝物所在代謝通路分布圖

2.5 通過代謝組學方法檢測SD大鼠血清和胰腺兩種樣本結果 與對照組比較，10%水合氯醛腹腔注射后血清代謝差異物共篩選出42種，均呈現明顯下降趨勢；胰腺樣本代謝差異物共篩選出20種，均呈現明顯下降趨勢。因此，可以得出10%水合氯醛對SD大鼠腹腔注射后，會導致大鼠機體代謝發生紊亂(表2)，提示動物實驗中采用水合氯醛作為麻醉劑應慎重考慮。

表2 血清和胰腺樣本篩選的代謝差異物

2.6 肝臟樣本篩選出1種代謝差異物 10%水合氯醛組與對照組比較，結果顯示2-羥基棕櫚酸上升2.48倍，具有統計學差異(P=0.035)。

2.7 血清、肝臟、胰腺多樣本的關鍵代謝物通路匯總圖 將上述差異代謝物用KEGG號注釋，然后基于KEGG通路繪制網絡圖(https://www.kegg.jp/)，見圖4。代謝網絡顯示共有3條代謝通路在水合氯醛作用下發生改變分別為：三羧酸循環代謝通路、脂質代謝通路(含膽固醇代謝)、氨基酸代謝通路(含谷胱甘肽代謝)；在水合氯醛作用下代謝網絡通過三羧酸循環為核心，通過聯系上游糖酵解途徑以及相關的脂質代謝、氨基酸代謝，影響血生化指標。

圖4 關鍵代謝物形成的通路匯總圖(血清、肝臟、胰腺樣本結果匯總)

3 討論

水合氯醛作為一種麻醉藥，本研究發現腹腔注射后機體血生化指標出現不同程度的異常，這與之前文獻報道是一致的[1-2]。然而，其影響機制尚無相關報道。

本研究的生化結果顯示水合氯醛導致的生化代謝改變體現在糖(血糖)、脂(膽固醇、甘油三酯)、蛋白質(總蛋白、白蛋白、酶蛋白)相關指標的紊亂，而代謝組學分析發現的代謝網絡以三羧酸循環為核心。值得注意的是，有研究指出三羧酸循環為聯系糖、脂、氨基酸(蛋白質)代謝的核心，這揭示了水合氯醛導致生化指標紊亂的機制。

本研究的關鍵生化指標改變為血糖含量上升，這主要與血液中6-磷酸葡萄糖下降有關，提示水合氯醛導致葡萄糖無法有效轉化為6-磷酸葡萄糖，而導致血糖的堆積，并且干擾下游三羧酸循環代謝[3-5]。三羧酸循環通路中間代謝物能代謝成氨基酸，氨基酸是合成蛋白質的前體，因此會導致血生化中總蛋白、白蛋白以及酶蛋白含量的變化[6]。三羧酸循環直接影響脂質和膽固醇代謝通路，因此導致了血生化中甘油三酯和膽固醇含量下降。對這些代謝標志物的檢測和干預有望實現對水合氯醛毒性的監測和防治。

本研究首次從代謝組學角度闡明了水合氯醛腹腔注射后血生化指標的變化機制，且形成了關鍵的代謝網絡，為今后水合氯醛在動物實驗和臨床用藥的安全性以及毒性的預防和治療提供了指導依據。