PCR-熒光探針?lè)z測(cè)嬰幼兒和兒童人鼻病毒的初步評(píng)估*

甘正飛，歐順婧，鄧國(guó)珍，黃曉雪，羅弘志，鄭 楊，查 何

遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(遵義市第一人民醫(yī)院)檢驗(yàn)科/中心實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563000

人鼻病毒(HRV)屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，是一組單股正鏈小分子RNA病毒，是引起人類呼吸道感染的最常見(jiàn)病原體之一[1]。HRV是嬰幼兒和兒童上呼吸道感染的重要病原體，感染HRV后大多數(shù)患兒急性起病，表現(xiàn)為咳嗽、流清涕、鼻塞、噴嚏、聲音嘶啞等普通感冒癥狀。近年來(lái)，有研究表明，HRV還可引起嬰幼兒及兒童的下呼吸道感染，包括支氣管炎及肺炎[2]，是兒童哮喘性疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素及加重的主要原因[3-4]。且HRV還可引起成人的慢性阻塞性肺疾病或伴免疫功能減弱者的下呼吸道感染[5-6]。臨床對(duì)于HRV的診斷多基于血清學(xué)診斷結(jié)果，但其檢測(cè)花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，往往會(huì)延誤患兒病程和增加醫(yī)療成本[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，快速、準(zhǔn)確的分子診斷技術(shù)成為臨床首選。目前測(cè)序法被公認(rèn)為基因檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[8]。本研究主要探討了PCR-熒光探針?lè)ㄏ噍^于Sanger測(cè)序法對(duì)HRV的檢測(cè)能力，并簡(jiǎn)要分析了HRV載量對(duì)嬰幼兒和兒童臨床指標(biāo)的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年5—7月遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治住院的有呼吸道感染癥狀的患兒175例為研究對(duì)象，并收集其鼻咽拭子標(biāo)本和臨床病例資料，其中男111例(63.43%)，女64例(36.57%)，年齡1月至13歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)選取臨床疑似為HRV感染的呼吸道感染病例，包括肺炎、支氣管炎等；(2)性別不限，年齡≤13歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)樣本量不足以檢測(cè)；(2)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)；(3)病情危重，不能配合采集標(biāo)本；(4)登記表記錄核心信息不完整；(5)標(biāo)本因收集或保存不當(dāng)不能用于檢測(cè)或檢測(cè)失敗。對(duì)于同一病例在不同時(shí)期采集的同類標(biāo)本不得重復(fù)入組。本研究經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 核酸提取或純化試劑盒與HRV核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?均購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。ABI Prism 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集和保存 將棉拭子輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，緩緩插入患兒鼻孔至顎部，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出，將鼻咽拭子置入無(wú)菌采樣管，密封送檢。所采集的標(biāo)本可立即用于測(cè)試，或長(zhǎng)期保存于-70 ℃冰箱中，也可以保存于-20 ℃冰箱中待測(cè)，保存期為6個(gè)月，標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)本運(yùn)送采用0 ℃冰壺或以泡沫箱加冰密封，低溫運(yùn)輸時(shí)間不應(yīng)超過(guò)8 h。

1.3.2檢驗(yàn)指標(biāo) 在175份標(biāo)本中139例為普通病區(qū)住院患兒，36例為兒童ICU住院患兒。來(lái)自兒童ICU的患兒因不同病因?qū)е缕洳∏閲?yán)重，因此本研究?jī)H對(duì)普通病區(qū)住院，經(jīng)PCR-熒光探針?lè)ㄅ凶x為陽(yáng)性的41例患兒的住院天數(shù)、入院前最高體溫、發(fā)熱天數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、降鈣素原及超敏C反應(yīng)蛋白進(jìn)行初步探討。

1.4PCR-熒光探針?lè)?/p>

1.4.1核酸提取 嚴(yán)格按照核酸提取或純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 根據(jù)HRV核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)將HRV PCR反應(yīng)液A與B室溫融化后振蕩混勻，8 000 r/min離心5～10 s后使用，按照所需將HRV PCR反應(yīng)液A(17 μL)+HRV PCR反應(yīng)液B(3 μL)加入總EP管振蕩混勻并短時(shí)離心，然后分裝到各PCR反應(yīng)管中，向其中加入提取后的待測(cè)標(biāo)本核酸、陰性質(zhì)控品核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品核酸5 μL，蓋緊管蓋，8 000 r/min離心5～10 s后擴(kuò)增檢測(cè)。ABI Prism 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀(美國(guó)ABI公司)設(shè)置擴(kuò)增程序如下：50 ℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 15 s→55 ℃ 45 s(采集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。

1.4.3質(zhì)量控制 (1)HRV陰性質(zhì)控品：FAM檢測(cè)通道無(wú)擴(kuò)增曲線，VIC檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線。(2)HRV陽(yáng)性質(zhì)控品：FAM檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線且Ct值≤32，VIC檢測(cè)通道有或無(wú)擴(kuò)增曲線。以上要求需在同一次試驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次試驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行。

1.4.4結(jié)果判讀 (1)若檢測(cè)標(biāo)本的FAM檢測(cè)通道無(wú)擴(kuò)增曲線，且該VIC通道有擴(kuò)增曲線，可判標(biāo)本為HRV陰性。(2)若檢測(cè)標(biāo)本的FAM檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線且Ct值≤40，VIC檢測(cè)通道有或無(wú)擴(kuò)增曲線，可判標(biāo)本為HRV陽(yáng)性。

1.5Sanger測(cè)序法 將PCR擴(kuò)增后的標(biāo)本外送華大基因公司(中國(guó)，廣州)進(jìn)行Sanger測(cè)序法測(cè)序，并將結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié) 果

2.1兩種方法檢出結(jié)果比較 采用PCR-熒光探針?lè)ㄔ?75份標(biāo)本中檢出陽(yáng)性標(biāo)本51份(29.14%)，陰性標(biāo)本124份(70.86%)。采用Sanger測(cè)序法在175份標(biāo)本中檢出陽(yáng)性標(biāo)本48份(27.43%)，陰性標(biāo)本127份(72.57%)。兩種方法檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.127，P>0.05)。見(jiàn)表1。與Sanger測(cè)序法比較，PCR-熒光探針?lè)z測(cè)HRV的靈敏度和特異度分別為100.00%和97.64%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為94.12%和100.00%，兩種方法的一致率為95.80%，見(jiàn)表2。此外，有3份標(biāo)本采用PCR-熒光探針?lè)z出結(jié)果Ct值位于37～40，被判為陽(yáng)性，而Sanger測(cè)序法檢出為陰性。

表1 兩種檢測(cè)方法檢出結(jié)果比較[n(%)]

表2 PCR-熒光探針?lè)ㄅcSanger測(cè)序法的一致性評(píng)價(jià)(n)

2.2HRV載量對(duì)患兒臨床指標(biāo)的影響 以患兒HRV平均Ct值(31.03±4.87)為分界線，將Ct值<31的患兒作為高載量病毒組，31≤Ct值≤40的患兒作為低載量病毒組。兩組住院天數(shù)、入院前最高體溫、發(fā)熱天數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比及降鈣素原比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，超敏C反應(yīng)蛋白比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 41例普通病區(qū)住院患兒住院天數(shù)和相關(guān)感染指標(biāo)的情況

3 討 論

據(jù)研究報(bào)道，HRV通常感染人類的上呼吸道，還可向下蔓延導(dǎo)致下呼吸道感染，其甚至是誘發(fā)兒童哮喘性疾病的重要原因[2-4]。由于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的限制，HRV在嬰幼兒和兒童急性呼吸道感染中的作用可能被低估，因此早期、快速、準(zhǔn)確地檢出HRV對(duì)臨床疾病的評(píng)估意義重大。本研究以HRV基因編碼區(qū)的高度保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針，進(jìn)行一步法RT-qPCR擴(kuò)增，用于標(biāo)本中HRV RNA的定性檢測(cè)。另外，擴(kuò)增體系中帶有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，用于對(duì)核酸提取過(guò)程及PCR擴(kuò)增過(guò)程的監(jiān)控，可減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，與Sanger測(cè)序法相比，PCR-熒光探針?lè)z測(cè)HRV具有較高的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，兩種方法的一致率為95.90%。兩種方法HRV檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與賴建輝等[7]、陳淑丹等[9]報(bào)道的PCR熒光探針?lè)z測(cè)HRV的有效率基本一致，說(shuō)明PCR-熒光探針?lè)ň哂锌焖佟㈧`敏度高、特異度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于HRV的快速檢測(cè)。

Sanger測(cè)序法是傳統(tǒng)的第一代DNA測(cè)序技術(shù)，被公認(rèn)為基因測(cè)序的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其靈敏度低，實(shí)際檢測(cè)中易出現(xiàn)假陰性結(jié)果[10-11]。在本研究PCR-熒光探針?lè)z測(cè)結(jié)果中，有3份標(biāo)本結(jié)果與Sanger測(cè)序法不一致，其Ct值位于37～40，提示當(dāng)Ct值偏大時(shí)，PCR-熒光探針?lè)▽?duì)HRV的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)判為可疑，需再次復(fù)查。但總體上兩種方法的檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

各地區(qū)、各年齡段、各季節(jié)HRV的檢出率均有差異。蔡曉瑩等[12]報(bào)道汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院住院的2 900多例呼吸道感染患兒中單一HRV檢出率為5.85%,患兒各年齡段中以嬰兒期組檢出率最高。張明新等[13]報(bào)道首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院收治的479例呼吸道感染患者臨床標(biāo)本中檢出率較高的為甲型流感病毒H1型(22.76%)，HRV為4.80%，但HRV在不同年齡段檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，原因可能是沒(méi)有納入嬰幼兒和兒童患兒的臨床標(biāo)本。余光清等[14]報(bào)道深圳地區(qū)急性上呼吸道感染患者中HRV的檢出率為18.27%；HRV感染以幼兒檢出率最高，其次為嬰兒和學(xué)齡前兒童；此外，HRV主要在春季、夏季、秋季檢出，冬季檢出較少。王豐等[15]報(bào)道自貢市第四人民醫(yī)院收治的急性呼吸道感染患者中HRV的檢出率為8.31%；呼吸道合胞病毒(RSV)秋季、冬季檢出率高,HRV春季、夏季檢出率高。從以上報(bào)告中可以看出，HRV的檢出率存在地區(qū)、年齡，甚至季節(jié)的差異，分析其原因可能與樣本量的多少、樣本收集的時(shí)間段，各年齡段納入人群量有關(guān)，還可能與不同地區(qū)溫度、濕度及氣候等差異有關(guān)，多種因素均可能影響病毒的易感性。而本研究收集標(biāo)本的時(shí)間段為腸道病毒高發(fā)季節(jié)[16]，納入人群、樣本量有限且未考慮腸道病毒的混合感染，因此本研究?jī)H探討HRV的檢出情況。HRV在本院的總體檢出情況還需長(zhǎng)時(shí)間、大樣本量的補(bǔ)充；而HRV在本地區(qū)的感染情況，還需多個(gè)哨點(diǎn)醫(yī)院的數(shù)據(jù)參與評(píng)估。

嬰幼兒和兒童身體器官和免疫功能尚未發(fā)育成熟，當(dāng)機(jī)體遭受病原體入侵時(shí)，其癥狀與成人患者大相徑庭，因此本研究?jī)H對(duì)嬰幼兒和兒童感染HRV后的臨床參數(shù)進(jìn)行對(duì)比分析。在實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)方面，本院感染HRV的患兒白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、超敏C反應(yīng)蛋白及降鈣素原等均超過(guò)正常范圍，高載量病毒組與低載量病毒組超敏C反應(yīng)蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與鄧敏等[17]報(bào)告的情況有偏移，這可能與本研究患兒病情較重有關(guān)。

綜上所述，Sanger測(cè)序法雖具有準(zhǔn)確性高且特異度高的優(yōu)點(diǎn)，但因其檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)費(fèi)用昂貴等問(wèn)題，目前其僅能在設(shè)備齊全、資金雄厚的基因檢測(cè)公司和國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)室使用，在普通醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室很難被推廣和應(yīng)用于臨床。而PCR-熒光探針?lè)z測(cè)HRV具有靈敏度高、特異度高、檢測(cè)周期短、費(fèi)用較低、操作簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)，可替代Sanger測(cè)序法在臨床檢測(cè)HRV感染，并能被廣泛推廣和應(yīng)用。此外，高載量HRV的嬰幼兒和兒童的超敏C反應(yīng)蛋白水平較低載量HRV的嬰幼兒和兒童更高。