人血清癌胚抗原發光免疫分析方法的建立及性能評價*

楊進波，焦 蓉，曹 琳，武軍駐，孫 莉，童 偉

1.湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院檢驗科，湖北襄陽 441000；2.武漢大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系，湖北武漢 430071；3.襄陽職業技術學院醫學實訓中心，湖北襄陽 441000

腫瘤標志物可用于胃癌、腸癌、肺癌、肝癌等常見腫瘤疾病的預防篩查、輔助診斷及復發監測[1]。癌胚抗原(CEA)是一種廣譜腫瘤標志物，可通過細胞膜分泌進入人體體液中[2]。健康人群血液中CEA濃度很低，部分吸煙人群血液中CEA濃度會升高[3]。目前，CEA被廣泛應用于各類惡性腫瘤的輔助診斷、篩查?；瘜W發光免疫分析法是將化學光信號檢測技術和免疫分析法相結合的一種新技術，該方法的靈敏度高，儀器操作智能簡便，檢測時間短，并且沒有放射性污染[4-5]。本研究通過雙抗夾心法原理建立人血清CEA發光免疫分析方法，并對各項性能進行了評估，選取雅培CEA檢測系統作為參比系統，調試檢測結果與世界公認的檢測系統靠攏，以期為國內臨床快速檢測CEA提供方法。

1 材料與方法

1.1材料來源 血清標本由湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院提供。

1.2儀器與試劑 SMART 500全自動化學發光免疫分析儀(科斯邁生物技術有限公司)、雅培i2000全自動化學發光免疫分析儀(美國雅培公司)、BY-L600型立式低速離心機(白洋醫療器械有限公司)、移液器[大龍興創實驗儀器(中國)有限公司]、CEA捕獲抗體和檢測抗體(金斯瑞生物科技有限公司)、CEA(海肽生物科技有限公司)、吖啶酯[西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司(Sigma-Aldrich)]、羧基磁珠(重慶博藍鷹生物技術有限公司)、CEA測定試劑盒(化學發光微粒子免疫檢測法，美國雅培公司)、ProClin 300[西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司(Sigma-Aldrich)]、新生牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1吖啶酯標記CEA檢測抗體 取pH=7.4的磷酸鹽緩沖液置換抗體緩沖體系，調整抗體濃度為1 mg/mL。吖啶酯用無水N,N-二甲基甲酰胺配制成3 mg/mL的溶液。取500 μL抗體溶液，加入一定量的吖啶酯溶液，室溫避光振蕩反應40 min。反應結束后用G25脫鹽純化柱純化后加入等體積甘油，儲存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2羧基磁珠偶聯CEA捕獲抗體 取1 mL濃度為10 mg/mL的羧基磁珠于EP管中，磁力架磁性分離磁珠和保存液，移液槍移除上清液，加入1 mL MES緩沖液，反復清洗2次后混合重懸于1 mL MES緩沖液中。重懸液中依次加入EDC和NHS活化劑，置于混勻儀中反應30 min，反應結束后置于磁力架中靜置，移除上清液，加入1 mL MES緩沖液，反復清洗2次。清洗結束，加入0.5 mL MES緩沖液重懸，再加入0.5 mL預處理的CEA捕獲抗體，置于混勻儀中反應120 min。反應結束后，用1 mL MES緩沖液反復清洗3次。加入磁珠封閉液封閉120 min后用1 mL MES緩沖液反復清洗3次，加入磁珠保存液于2～8 ℃冰箱中備用。

1.3.3CEA校準品配制 新生牛血清中加入0.1% ProClin 300，混勻儀混勻60 min后制備成校準品稀釋液，經雅培i2000全自動化學發光免疫分析儀檢測CEA濃度低于檢測下限，可用作CEA校準品的配制。將CEA用校準品稀釋液分別配制成濃度為0.0、1.0、2.5、50.0、100.0、1 000.0 ng/mL的校準品，各濃度使用雅培CEA檢測系統進行標定，溯源至國際標準品NIBSC73/601。

1.3.4檢測方法設定 使用SMART 500全自動化學發光免疫分析儀設定檢測程序，將20 μL標本、包被在羧基磁珠上的CEA捕獲抗體、吖啶酯標記的CEA標記抗體加入到反應杯中，37 ℃恒溫條件下孵育反應一定時間形成磁珠-CEA捕獲抗體-抗原-CEA標記抗體-吖啶酯復合物。利用磁場吸引復合物，清洗液洗滌后，加入100 μL預激發液和100 μL激發液。免疫復合物中的吖啶酯在兩種試劑的作用下會形成激發態中間體，激發態回到基態時會發出恒定波長的可見光，通過SMART 500全自動化學發光免疫分析儀中的傳感器可檢測到反應過程中的發光強度。發光強度與標本中的CEA濃度在線性范圍內呈正相關，四參數Logistic方程進行擬合后，即可計算得到血清標本中CEA的濃度。

1.3.5羧基磁珠偶聯CEA捕獲抗體濃度及工作濃度的篩選 采用棋盤實驗法。分別向10 mg磁珠中加入0.05、0.10、0.20 mg的CEA捕獲抗體進行偶聯，分別按照200∶1、100∶1、50∶1的質量比進行偶聯(因素A)。每個羧基磁珠偶聯物，其工作濃度分別按照1∶5、1∶10、1∶20的稀釋比例進行稀釋(因素B)，采用雙因素交叉實驗，評估校準品擬合的線性及校準品1(S1)與零濃度校準品(S0)信噪比(S1/S0)。

1.3.6吖啶酯標記CEA檢測抗體濃度及工作濃度的篩選 采用棋盤實驗法。分別向5 μg吖啶酯試劑中加入25、50、100 μg的CEA檢測抗體進行標記，分別按照1∶5、1∶10、1∶20的質量比進行標記(因素A)。每個濃度的標記物其工作濃度分別按照1∶500、1∶1 000、1∶2 000的比例進行稀釋(因素B)，采用雙因素交叉實驗。評估校準品擬合的線性和S1/S0。

1.3.7反應時間選擇 確定了羧基磁珠偶聯CEA捕獲抗體、吖啶酯標記CEA檢測抗體的工作濃度后，進一步探究最佳的反應時間。設定反應時間分別為5、8、10、15 min，通過評估不同時間下校準品的回歸曲線選擇最佳反應時間。

1.4統計學處理 采用Excel2019及SPSS20.0軟件進行數據處理及統計分析。呈偏態分布的計量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用配對Wilconxon符號秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1方法學建立

2.1.1羧基磁珠偶聯CEA捕獲抗體濃度及工作濃度確定 隨著CEA捕獲抗體濃度的升高，其線性相關系數(r)呈升高趨勢。隨著羧基磁珠濃度的升高，信噪比隨之降低。因此，根據CEA校準曲線的線性和信噪比情況，篩選出最優的偶聯條件為羧基磁珠與CEA捕獲抗體質量比為100∶1，羧基磁珠工作濃度為1∶10，在該條件下其r值和信噪比最優，并且原料用量較少。見表1。

表1 不同包被濃度及稀釋比例的選擇

2.1.2吖啶酯標記CEA檢測抗體濃度及工作濃度確定 吖啶酯標記的CEA偶聯物稀釋至1∶1 000時，其信噪比降低，在稀釋比例為1∶1 000時，標記物的線性和信噪比能達到最優。因此，篩選出最優偶聯條件為吖啶酯與CEA檢測抗體質量比為1∶10，吖啶酯標記的CEA偶聯物的稀釋比例為1∶1 000時，其校準曲線擬合的r值和信噪比最優，并且原料用量較少。見表2。

表2 不同標記物濃度及稀釋比例的選擇

2.1.3反應時間確定 設定反應時間分別為5、8、10、15 min，評估不同時間下校準品的回歸曲線，結果見圖1。隨反應時間的延長，校準品各個濃度點的相對發光值也隨之升高，升高到一定時間后基本達到平衡，為實現臨床快速檢測，因此反應時間選擇10 min。

圖1 不同反應時間下的校準品相對發光值

2.2試劑性能評價

2.2.2線性范圍 接近線性范圍上限的CEA高濃度標本和接近線性范圍下限的CEA低濃度標本混合成5個稀釋濃度(xi)(包括下限、中限及上限)，即配制濃度為0.40、200.16、400.24、600.16、800.08、1 000.00 ng/mL的線性參考品，每個稀釋濃度測試3次，分別求出測定結果的均值(yi)。以稀釋濃度(xi)的對數為自變量，以測定結果均值(yi)的對數為因變量擬合線性，見圖2，根據擬合的線性方程，結果表明本方法在0.4～1 000.0 ng/mL范圍內的r為0.999 6，線性范圍符合行業標準要求。

圖2 線性范圍實驗結果

2.2.3準確度 取已知濃度的高濃度CEA標本(濃度記為Xs)和已知濃度的低值血清標本；將參考品與低值血清標本以1∶9的體積比進行混合，然后分別檢測低值血清標本和混合標本，每個標本重復檢測3次，計算檢測結果的平均值X0和X。根據公式回收率(P)=(10X-9X0)/Xs×100%計算出P，本方法的P為102.70%，說明P在85.00%～115.00%范圍內，符合準確度要求。

2.2.4精密度 配制預期濃度為100 ng/mL和10 ng/mL高、低兩個濃度的樣品，分別重復檢測10次，計算高、低兩個濃度的批內精密度，見表3。重復3次實驗，分別統計高、低兩個濃度的30次檢測結果并計算高、低兩個濃度的批間精密度，見表4，結果顯示，本檢測方法批內精密度分別為5.12%、5.17%，批間精密度分別為5.60%、5.52%，這一結果表明本檢測方法的精密度均優于行業標準要求。

表3 批內精密度(n=10，ng/mL)

表4 批間精密度(n=30，ng/mL)

2.2.5HOOK效應 使用CEA，配制濃度為160 000、120 000、60 000、30 000、15 000、1 000 ng/mL的CEA高值標本。同時配制后的高值標本，制作濃度相對發光值曲線，見圖3，分析曲線可知，當CEA濃度超過120 000 ng/mL時出現拐點，說明CEA濃度最高達到120 000 ng/mL時，未出現HOOK效應。

圖3 HOOK效應濃度-RLU值曲線

2.2.6與雅培CEA檢測系統比對 使用雅培CEA檢測系統，與本方法同時測定200份臨床血清標本CEA濃度，二者相關性見圖4，相關性方程為Y=1.004 6X+0.073 4，r=0.994 9。通過分析這兩種方法的標本檢測結果比較，差異無統計學意義(P=0.468)。結果表明，本方法與雅培CEA檢測系統臨床標本結果的相關性較好。

圖4 兩種試劑盒測定結果的相關性

3 討 論

化學發光免疫分析法是一種高靈敏度、高特異度的檢測方法，即將高靈敏度的化學分析方法和高特異度的免疫學反應相融合的一項技術，符合臨床檢驗需求?；瘜W發光免疫分析法以其線性范圍寬、靈敏度高、特異度高、精確定量等優勢，逐步替代傳統的酶聯免疫吸附試驗和定性產品，同時早期的微孔板式化學發光法也逐步被磁微粒化學發光技術所取代[6-7]。從目前化學發光法市場占有率和主流技術應用看，非酶參與的直接化學發光免疫分析法、電化學發光法占比高于酶促化學發光法，直接化學發光法標記物相對分子質量很小，便于對小分子物質進行標記，能檢測的項目多于酶促化學發光法，在臨床檢驗中應用更廣泛。以吖啶酯標記的化學發光免疫分析法屬于直接化學發光法，體系標記簡單，無需酶催化和增強劑的作用，能明顯降低化學發光背景值，提高信噪比，干擾作用少，同時，還表現出光釋放集中迅速、發光強度和發光效率高的特點[8]，此外，由于其相對分子質量較小，易與抗體結合，且對抗體構像影響小，標記后比較穩定，現如今在直接化學發光免疫分析法中成為主流。

在一般情況下，CEA能夠通過胃腸道代謝作用，維持一種動態平衡，并處于較低濃度。在惡性腫瘤發生、發展過程中，血清中的CEA可進入血液循環，因此，在胰腺癌、肺癌、結腸腺癌、肝細胞癌和胃癌患者血清中CEA濃度明顯升高[9]。CEA作為臨床試驗中的腫瘤標志物，已逐漸成為臨床上診斷腫瘤的重要輔助指標之一，定量檢測血清中的CEA濃度在惡性腫瘤手術后的療效評估及預后觀察中發揮重要作用[10-11]，另外，CEA也可輔助檢測用于部分癌癥患者的靶向治療[12]。目前，臨床上用于檢測CEA的手段方法多樣，同時也有不少研究對CEA檢測方法進行了報道。薛盼等[13]構建了基于辣根過氧化物酶(HRP)催化發光的CEA分析檢測方法，該方法可基本滿足醫院檢測，但是由于HRP不及堿性磷酸酶(ALP)穩定[14]，目前大多數試劑廠家將HRP體系更換為更加穩定的ALP體系。李雪萌[15]構建了一種基于納米材料的CEA熒光免疫檢測方法，該方法的優勢是設備更加小巧便攜，操作更加靈活，但在準確度、靈敏度及抗背景干擾等性能方面不及化學發光法。周齊洋等[16]報道了基于鏈霉親和素-生物素體系的CEA直接發光檢測方法，該方法性能出色，各項技術指標均達到國家標準要求，但是該方法用的主要試劑均為進口試劑，且儀器為封閉系統。

本研究成功建立了基于磁微粒化學發光系統的CEA定量檢測方法，并應用所建立的方法與雅培CEA檢測系統同時檢測200份臨床血清標本。本方法性能評估結果顯示，所建立方法的空白限、準確度、線性范圍、批內精密度、批間精密度等性能指標均滿足行業標準，與雅培CEA檢測系統臨床標本結果的相關性較好，說明本研究所研制的CEA定量檢測方法達到了臨床診斷的要求。本研究采購的大部分主要原料為國產試劑，生產成本較低，可降低檢測費用。此外，本研究中CEA定量檢測方法使用儀器為國產開放式全自動化學發光免疫分析儀，適宜國內臨床推廣，有助于推進國內診斷試劑國產化。