血清miR-499-5p、鐵調(diào)素20聯(lián)合檢測(cè)在急性心肌梗死診斷中的應(yīng)用*

周 云，鎮(zhèn)海濤，郭 芬，李 軍,魏家興,彭藝靈

湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部國(guó)家級(jí)全科醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，湖北咸寧 437100

急性心肌梗死(AMI)是由心肌持續(xù)性缺血所致的急性組織壞死，具有極高的發(fā)病率和死亡率[1]。微小RNA(miRNA)是非編碼RNA分子，在血液和組織中均能穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)脂類代謝及染色體重構(gòu)等過(guò)程均具有調(diào)控作用[2]。miR-499-5p主要在哺乳動(dòng)物的心肌和骨骼肌中高度表達(dá)，正常生理?xiàng)l件下機(jī)體血清中的miR-499-5p水平較低[2]。ZHOU等[3]發(fā)現(xiàn)，miR-499-5p能夠作用于多種心肌細(xì)胞特征性基因靶點(diǎn)，從而調(diào)控心肌細(xì)胞的凋亡、增生及分化等過(guò)程。鐵調(diào)素(Hepc)是一種由肝臟合成的抗菌多肽，由25個(gè)氨基酸組成，對(duì)機(jī)體內(nèi)鐵離子的穩(wěn)定具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[4]。HAN等[5]發(fā)現(xiàn)，炎性反應(yīng)能夠刺激機(jī)體釋放大量的白細(xì)胞介素-6(IL-6)進(jìn)入血液循環(huán)，從而促進(jìn)Hepc-20合成。因此，本研究旨在探討miR-499-5p和Hepc-20聯(lián)合檢測(cè)對(duì)AMI的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月至2021年6月于本中心收治的AMI患者96例作為AMI組，并根據(jù)心電圖ST段是否抬高將其分為ST抬高型心肌梗死(STEMI)組(48例)和非ST抬高型心肌梗死(NSTEMI)組(48例)。同時(shí)，選取同年齡段的心絞痛患者及健康者各96例，作為心絞痛組和健康組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)AMI組符合文獻(xiàn)[6]中對(duì)AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且均經(jīng)冠脈造影證實(shí)；(2)無(wú)心肌梗死既往史；(3)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查及基本資料完整；(4)從發(fā)病到入院搶救的時(shí)間不超過(guò)6 h。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并慢性心力衰竭；(2)兩周內(nèi)服用過(guò)鐵劑或接受了輸血治療；(3)合并其他惡性腫瘤(如白血病、惡性淋巴瘤及腎癌等)；(4)合并心臟瓣膜疾病、急性心肌炎及心肌病等嚴(yán)重心臟疾病；(5)合并凝血功能障礙。本研究經(jīng)本中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有受試者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2標(biāo)本采集 所有受試者均于肘靜脈處抽取10 mL靜脈血置于抗凝管中，通過(guò)離心機(jī)(生產(chǎn)廠家：山東博科科學(xué)儀器有限公司；型號(hào)：TD-6M)以6 000 r/min離心5 min，取其上層清液置于試管中，于-80 ℃冰箱中保存。

1.3檢測(cè)方法 采用miRNA分離試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：20200513)提取總RNA，嚴(yán)格遵循試劑盒的操作規(guī)定。將提取的總RNA滴入20 μL無(wú)核糖核酸酶的水中溶解，通過(guò)紫外分光光度儀(美國(guó)Promega公司)檢測(cè)A260值和A280值，計(jì)算其RNA的純度和濃度，選取A260/A280比值在1.8～2.0的標(biāo)本用于后續(xù)試驗(yàn)。利用HG TaqMan miRNA試劑盒(新海基因檢測(cè)有限公司，批號(hào)：20200526)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過(guò)SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，批號(hào)：20200516)定量檢測(cè)miR-499-5p的表達(dá)量。miR-499-5p的反應(yīng)條件均為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增體系為：SYBR Premix 10 μL、cDNA標(biāo)本3.0 μL、ddH2O 5.0 μL、正向引物1.0 μL及反向引物1.0 μL，共計(jì)20 μL。miR-499-5p的正向引物序列為5′-CGT GTC GAC CAA GTC TGG GGT GAA AGA GAA G-3′、反向引物序列為5′-TGT GTC GAC GGT CAT GAG CTT GTT GAG GTT C-3′。內(nèi)參基因U6的正向引物序列為5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′、反向引物序列為5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。miR-499-5p的PCR反應(yīng)條件均為預(yù)變性95 ℃ 20 s、變性95 ℃ 20 s、退火60 ℃ 30 s、延伸70 ℃ 5 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物序列由蘇州瑞博生物技術(shù)股份有限公司合成。以相對(duì)Ct值法檢測(cè)miR-499-5p的相對(duì)表達(dá)水平，相對(duì)于U6的比值為2-ΔΔCt，以ΔCt值為結(jié)果，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

總膽固醇(TC)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、高密度脂蛋白(HDL)、三酰甘油(TG)、血肌酐(Cr)及低密度脂蛋白(LDL)采用全自動(dòng)生化分析儀(瑞士羅氏公司，型號(hào)：COBAS INTEGRA 800)檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中Hepc-20水平，嚴(yán)格遵守試劑盒(上海古朵生物科技有限公司，批號(hào)：20200522)流程操作，其中線性范圍為12.5～300.0 μg/L。

2 結(jié) 果

2.13組受試者的一般資料 AMI組血清中的miR-499-5p、Hepc-20、cTnI、LDL水平較心絞痛組和健康組升高(P<0.05)；AMI組血清中的HDL水平較心絞痛組和健康組降低(P<0.05)；AMI組和心絞痛組TG水平較健康組升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組受試者的一般資料[n/n或或n(%)]

組別nHDL(mmol/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)Cr(μmol/L)cTnI(μg/L)miR-499-5pHepc-20(μg/L)AMI組961.03±0.24ab1.98±0.95a4.23±1.8583.52±33.164.23±1.96ab1.37±0.25ab94.66±21.23ab心絞痛組961.66±0.31a1.85±0.86a4.12±1.9966.03±31.051.33±0.51a0.95±0.18a63.21±16.99a健康組963.16±1.251.56±0.724.01±1.9271.39±35.661.16±0.420.69±0.2222.06±6.78

2.2STEMI和NSTEMI組患者血清miR-499-5p和Hepc-20水平比較 兩組血清中的miR-499-5p和Hepc-20水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 STEMI和NSTEMI組患者血清miR-499-5p和Hepc-20水平比較

2.3二元Logistic回歸模型分析發(fā)生AMI的獨(dú)立影響因素 二元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-499-5p、Hepc-20、cTnI及LDL水平升高是影響AMI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 二元Logistic回歸模型分析發(fā)生AMI的獨(dú)立影響因素

2.4AMI患者血清中miR-499-5p和Hepc-20與cTnI的相關(guān)性分析 miR-499-5p和Hepc-20均與cTnI呈正相關(guān)(r=0.746、0.871，P<0.05)。

2.5血清中miR-499-5p、Hepc-20對(duì)AMI的診斷效能 將AMI組和心絞痛組作為分析對(duì)象，以是否發(fā)生AMI為前提繪制ROC曲線，miR-499-5p和Hepc-20的最佳截?cái)嘀捣謩e為1.27、90.00 μg/L，miR-499-5p和Hepc-20的曲線下面積(AUC)分別為0.806、0.838。miR-499-5p和Hepc-20聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.877，明顯大于miR-499-5p或Hepc-20單項(xiàng)檢測(cè)的AUC，聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為90.24%、78.05%，見(jiàn)表4、圖1。

表4 血清中miR-499-5p、Hepc-20對(duì)AMI的診斷效能

圖1 血清中miR-499-5p、Hepc-20診斷AMI的ROC曲線

3 討 論

AMI是冠心病最嚴(yán)重的結(jié)果，據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)每年因AMI死亡人數(shù)已達(dá)3 000 000～4 000 000，且呈不斷上升的趨勢(shì)[1]。人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)的改變及遺傳易感性是導(dǎo)致AMI的重要因素。雖然冠狀動(dòng)脈造影對(duì)確診AMI具有重要意義，但其在臨床實(shí)踐中受諸多限制，且屬于有創(chuàng)操作。目前，cTnI是診斷AMI最常用的生化指標(biāo)，其對(duì)心臟損傷的靈敏度和特異度均較高，但終末期腎臟疾病或腎損傷也會(huì)導(dǎo)致cTnI水平升高，影響結(jié)果準(zhǔn)確度[7]。同時(shí)，cTnI通常在AMI發(fā)生后的4～8 h才升高，且在12～24 h才能達(dá)到峰值，這不利于AMI早期診斷，使再灌注治療的間隔延長(zhǎng)，增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[7]。因此，cTnI的實(shí)際應(yīng)用存在一定弊端，需要更多有效指標(biāo)輔助診斷AMI。

miRNA屬于內(nèi)源性小RNA分子，不能編碼RNA，其長(zhǎng)度為21～26個(gè)核苷酸，能結(jié)合靶基因的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)，從而影響轉(zhuǎn)錄后的分子活動(dòng)。體內(nèi)循環(huán)血液中miRNA的分子長(zhǎng)度較短，并具有抗酸、抗堿及抗RNA酶的能力，使其能夠穩(wěn)定存在于血液中[2]。miR-499-5p屬于肌球蛋白Myh7b家族，在心肌細(xì)胞的外泌體中分泌較多，對(duì)心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化及心室重構(gòu)具有重要的調(diào)控作用，與心血管疾病關(guān)系密切[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在家兔模型中，阻遏miR-499-5p表達(dá)能夠提高心肌細(xì)胞中線粒體膜的穩(wěn)定程度，延緩家兔心臟重構(gòu)過(guò)程[8]。李世櫻等[9]發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入miR-499-5p抑制劑后，受損的心肌細(xì)胞膜電位逐漸恢復(fù)，房顫誘發(fā)率明顯下降。研究表明，miR-499-5p高表達(dá)能夠降低心肌細(xì)胞對(duì)應(yīng)激刺激的敏感性，導(dǎo)致心臟壓力超負(fù)荷，心肌細(xì)胞受損，誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的心功能不全[10]。本研究結(jié)果顯示，AMI組血清miR-499-5p相對(duì)表達(dá)水平較心絞痛組和健康組升高(P均<0.05)。其原因可能是心肌細(xì)胞損傷、壞死后，細(xì)胞破裂，使其內(nèi)外泌體合成并存儲(chǔ)的大量miR-499-5p釋放入血，導(dǎo)致AMI患者血清miR-499-5p相對(duì)表達(dá)水平升高[9]。Hepc的基因位于19號(hào)染色體上，由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子組成，其中Hepc由第3個(gè)外顯子編碼。Hepc分為Hepc-20、Hepc-22、Hepc-25，其中Hepc-20和Hepc-25屬于同一基因的異構(gòu)體[5]。Hepc-20主要存在于血液和尿液中，包含2條β鏈，以二硫鍵的連接方式形成穩(wěn)固的階梯狀結(jié)構(gòu)[5]。研究表明，肝細(xì)胞在合成促紅細(xì)胞生成素(EPO)時(shí)，機(jī)體內(nèi)紅細(xì)胞含量增加，這能夠使肝臟合成Hepc-20的過(guò)程受阻[11]。心肌細(xì)胞外的過(guò)量鐵離子能夠激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而釋放活性氧(ROS)，增加心肌損傷的易感性[12]。本研究結(jié)果顯示，AMI組血清Hepc-20水平較心絞痛組和健康組升高(P均<0.05)。其原因可能是發(fā)生AMI時(shí)，機(jī)體因免疫系統(tǒng)的作用能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞分化，從而釋放大量的炎癥因子和趨化因子，促進(jìn)Hepc-20合成增加并釋放入血[13]。

cTnI是一種與心肌肌肉收縮相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白，是臨床診斷心肌損傷最常用的生化指標(biāo)，其在健康人體血清中水平較低，但當(dāng)發(fā)生心肌細(xì)胞損傷時(shí)，其水平會(huì)升高[7]。LDL是一種運(yùn)載膽固醇的脂蛋白顆粒，當(dāng)其過(guò)量時(shí)會(huì)使膽固醇堆積在冠狀動(dòng)脈血管壁上，造成冠狀動(dòng)脈痙攣[14]。二元Logistic回歸分析顯示，miR-499-5p、Hepc-20、cTnI及LDL水平升高是影響AMI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，提示血清中miR-499-5p、Hepc-20、cTnI及LDL的水平對(duì)AMI的發(fā)生至關(guān)重要，可能成為篩查AMI的潛在生化指標(biāo)。而STEMI和NSTEMI患者血清miR-499-5p和Hepc-20水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，提示miR-499-5p和Hepc-20只能反映AMI可能存在，但無(wú)法判別AMI的具體類別。miR-499-5p和Hepc-20均與cTnI呈正相關(guān)(P均<0.05)，提示miR-499-5p、Hepc-20與臨床常用指標(biāo)cTnI具有較好的一致性。其原因可能是miR-499-5p高表達(dá)時(shí)，能夠抑制肌球蛋白重鏈表達(dá)，降低心肌氧代謝和耐受性，使心肌損傷風(fēng)險(xiǎn)增加，這與cTnI的作用具有相似性，二者之間可能存在協(xié)同作用[3,15]。Hepc-20與cTnI之間存在的具體作用機(jī)制目前尚不清楚，需要后續(xù)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究，但可能與AMI誘導(dǎo)的機(jī)體炎性反應(yīng)使Hepc-20水平升高，同時(shí)心肌細(xì)胞溶解后釋放cTnI入血有關(guān)[13,16]。ROC曲線結(jié)果顯示，miR-499-5p聯(lián)合Hepc-20檢測(cè)的AUC明顯高于miR-499-5p或Hepc-20單項(xiàng)檢測(cè)的AUC，其靈敏度和特異度分別為90.24%和78.05%(P<0.05)，提示miR-499-5p和Hepc-20聯(lián)合檢測(cè)能夠提高對(duì)AMI的鑒別診斷價(jià)值，且靈敏度和特異度均較高，對(duì)于區(qū)別心絞痛和AMI具有重要的臨床意義。本研究結(jié)果顯示，miR-499-5p聯(lián)合Hepc-20檢測(cè)的靈敏度較單項(xiàng)檢測(cè)明顯提高，提示二者聯(lián)合對(duì)早期篩查AMI具有較高價(jià)值。

AMI患者血清中miR-499-5p和Hepc-20水平均升高，且是AMI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在輔助診斷AMI時(shí)，miR-499-5p、Hepc-20與臨床常用指標(biāo)cTnI具有較好的一致性。miR-499-5p聯(lián)合Hepc-20檢測(cè)對(duì)AMI具有良好的診斷效能，且診斷的真實(shí)性可靠，為臨床實(shí)施進(jìn)一步治療提供有利支持。但AMI患者血清中miR-499-5p和Hepc-20水平變化的具體機(jī)制尚不清楚，需要在接下來(lái)的研究中逐步證實(shí)。