普通培養(yǎng)法聯(lián)合革蘭染色Nugent評分在BV相關(guān)GV鑒別診斷中的臨床應(yīng)用

陸庭嫣，曹軼越，劉安慶，沈 俐，肖 曄，方曉霞，楊海鷗

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院檢驗科/上海市胚胎源性疾病重點實驗室，上海 200030

陰道加德納菌(GV)是女性細(xì)菌性陰道病(BV)的主要病原菌之一。妊娠期女性GV感染可引起輸卵管妊娠、胎膜早破、絨毛膜羊膜炎、新生兒早產(chǎn)、新生兒敗血癥、產(chǎn)后敗血癥和膿毒血癥等不良妊娠結(jié)局[1-3]；非妊娠期感染可引起輸卵管炎、盆腔炎、間質(zhì)性膀胱炎等婦科疾病[4-5]。BV相關(guān)GV感染是陰道微生態(tài)菌群紊亂的表現(xiàn)，在陰道菌群平衡被打破的狀態(tài)下容易合并多種病原菌感染[6-8]。因此，本研究對本院2018年BV相關(guān)GV檢出率、臨床分布及與其他病原菌合并感染等情況進行了統(tǒng)計分析，旨在探索一種能正確識別BV相關(guān)GV感染的方法，并結(jié)合與其他病原菌混合感染情況，為BV感染患者針對性、綜合性治療提供一定的科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2018年所有檢測女性陰道拭子或?qū)m頸拭子普通病原菌培養(yǎng)項目的門診及住院患者。

1.2儀器與試劑 基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS，布魯克)、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(科馬嘉)、革蘭染色試劑(珠海貝索)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 用無菌棉拭子于陰道深部或陰道后穹窿、宮頸口等處取材，采集完成后將棉拭子放入標(biāo)本保存管內(nèi)，立即送檢。

1.3.2普通培養(yǎng)法 取出標(biāo)本保存管內(nèi)棉拭子，在哥倫比亞血瓊脂平板上均勻涂抹一區(qū)，用接種環(huán)分區(qū)劃線接種。將接種好標(biāo)本的哥倫比亞血瓊脂平板置于37 ℃、5%～10%CO2的CO2培養(yǎng)箱中孵育于24、48 h后觀察。GV在哥倫比亞羊血瓊脂中不溶血，菌落特征為細(xì)小灰白色，染色性為革蘭陰性小桿菌或陰陽性不定小桿菌[9]。

1.3.3質(zhì)譜鑒定 由于GV菌落較為細(xì)小，所以用竹牙簽盡可能多地挑取上述可疑菌落均勻涂抹在MALDI靶板的標(biāo)本孔位中，同時添加1 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液至1個標(biāo)本孔位中，在自然晾干后的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本上加1 μL70%甲酸，晾干后再加1 μL基質(zhì)溶液。自然晾干后將靶板放入靶板艙，進行樣品測定。

1.3.4質(zhì)譜鑒定 質(zhì)控菌株為GV標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC14018。參照IVD MALDI Biotyper2.3用戶手冊，將臨床標(biāo)本GV鑒定分值≥2.000的結(jié)果確認(rèn)為種的水平，鑒定分值在1.700～1.999的結(jié)果確認(rèn)為屬的水平。

1.3.5革蘭染色 在對培養(yǎng)平板上有可疑GV菌落質(zhì)譜鑒定的同時也將其拭子標(biāo)本進行涂片革蘭染色。涂片干燥后經(jīng)火焰固定，加結(jié)晶紫染10 s，清水沖去染液；加碘液染10 s，水洗；加95%乙醇脫色液，不時搖動5～10 s，至無紫色脫落為止，水洗；加沙黃復(fù)染10 s，水洗。干燥后置于顯微鏡10×100油鏡下觀察陰道菌群進行Nugent評分。

1.3.6Nugent評分[10]Nugent評分是國際通用的較準(zhǔn)確診斷BV的實驗室方法。顯微鏡10×100油鏡區(qū)分以下形態(tài)的細(xì)菌：革蘭陽性大桿菌(乳酸桿菌)、革蘭染色陰陽性不定小桿菌(GV)、革蘭陰性小桿菌(擬桿菌)、革蘭染色陰陽性不定的彎曲桿菌(動彎桿菌)等。根據(jù)每個油鏡視野細(xì)菌數(shù)量，換算成積分，再按公式(總積分=乳酸桿菌+GV和擬桿菌+動彎桿菌)計算總積分。Nugent評分0～3分為正常；>3～<7分為中間型；≥7分為BV。

1.3.7病例查詢 通過患者門診號或住院號查詢BV相關(guān)GV患者需氧菌、真菌、支原體培養(yǎng)及其他檢測信息，統(tǒng)計BV相關(guān)GV患者合并混合感染種類和感染率。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1普通培養(yǎng)法聯(lián)合革蘭染色Nugent評分的GV檢出情況分析 2018年共有8 653份做病原菌培養(yǎng)檢測的女性陰道拭子或?qū)m頸拭子標(biāo)本。當(dāng)普通培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)哥倫比亞血瓊脂平板有GV特征性菌落生長時，挑取可疑菌落用MALDI-TOF MS儀進行鑒定，最終檢出GV 881份，檢出率10.18%。GV鑒定陽性且Nugent≥7分的有691份(78.43%)，為BV相關(guān)GV組；GV鑒定陽性但Nugent<7分的有190份(21.57%)，為GV定植菌組；GV鑒定失敗但Nugent≥7分的有123份。在Nugent評分≥7分的標(biāo)本里有75.92%可見典型線索細(xì)胞。

2.2BV相關(guān)GV組患者臨床分布 691例BV相關(guān)GV組患者門診分布以婦科門診最多(48.48%，335/691)，其次為宮頸門診(12.74%，88/691)。病區(qū)分布以腫瘤病區(qū)最多(8.97%，62/691)、其次為婦科內(nèi)窺鏡病區(qū)(6.51%，45/691)，產(chǎn)科病區(qū)最少(3.33%，23/691)。見表1。

表1 BV相關(guān)GV組患者臨床分布

2.3BV相關(guān)GV組患者混合感染類型分布 691例BV相關(guān)GV組患者中，混合感染632例，混合感染率91.45%。混合感染病原菌主要包括需氧菌(AV)、陰道假絲酵母菌(VVC)、解脲支原體(UU)、人型支原體(MH)、衣原體(CT)、滴蟲(TV)、淋球菌(GC)、皰疹病毒2型(HSV-2)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)等。不同混合感染例數(shù)與感染率見表2。

表2 BV相關(guān)GV組患者混合感染類型分布(n=691)

3 討 論

BV是以陰道正常優(yōu)勢乳酸桿菌比例下降或缺失，相關(guān)微生物過度增殖而引起的無陰道黏膜炎癥表現(xiàn)的臨床綜合征。與BV相關(guān)的微生物主要有GV、擬桿菌、動彎桿菌、普雷沃菌屬、UU、MH等[11]。雖然有研究顯示GV是BV相關(guān)致病菌中最主要的病原菌[12-13]，但有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)與指南并不推薦以單純分離培養(yǎng)GV作為診斷BV的方法[14]。因為GV可以存在于超過50%的健康女性陰道微生物菌群中，只有高濃度GV才常與BV發(fā)生有關(guān)[11]，所以并不能以單純培養(yǎng)結(jié)果作為獨立的BV診斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，2015年美國指南建議，使用革蘭染色Nugent 評分(首選)或Amsel標(biāo)準(zhǔn)作為診斷BV的“金標(biāo)準(zhǔn)”[14]。

筆者在日常工作中發(fā)現(xiàn)，本院的女性陰道拭子或?qū)m頸拭子在進行病原菌培養(yǎng)檢測過程中，常常被發(fā)現(xiàn)在哥倫比亞血瓊脂平板上有生長比較良好單一的細(xì)小灰白GV特征菌落，也有與其他需氧菌混合生長的GV菌群。雖然有研究者認(rèn)為，GV生長營養(yǎng)要求苛刻，需要配置專用培養(yǎng)基才能良好生長[15]，但本實驗室在實際培養(yǎng)觀察中發(fā)現(xiàn)，GV在哥倫比亞血瓊脂平板上亦可生長良好且比較容易區(qū)分辨認(rèn)。為了能正確區(qū)分BV相關(guān)GV及避免因菌群混雜導(dǎo)致GV鑒定失敗而造成BV漏檢，筆者在對培養(yǎng)平板上有可疑GV菌落質(zhì)譜鑒定的同時也將其拭子標(biāo)本進行革蘭染色Nugent評分，從而確認(rèn)了691例(78.43%)GV與BV相關(guān)患者，另外也補充了GV鑒定失敗但革蘭Nugent評分判定為BV陽性的123例，所以該方法可以作為BV診斷的一種補充檢測手段，在指導(dǎo)臨床針對性治療BV相關(guān)GV、避免藥物濫用等方面可發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示，BV相關(guān)GV患者以婦科門診(48.48%，335/691)和宮頸門診(12.74%，88/691)最多。這可能是因為婦科門診和宮頸門診就診患者多為有臨床癥狀的陰道病感染高危人群。在GILLET等[16]的一篇Meta分析中也提到，BV與宮頸HPV感染呈顯著相關(guān)。而體檢門診人群以健康者為主，相對應(yīng)的BV相關(guān)GV檢出率也較低(2.53%，12/475)，符合人群分布特點。婦科相關(guān)病區(qū)(腫瘤病區(qū)、內(nèi)窺鏡、婦科病區(qū))BV相關(guān)GV檢出率(7.55%，151/2 000)明顯高于產(chǎn)科病區(qū)(2.72%，23/845)，提示BV感染可能與婦科生殖道各類疾病密切相關(guān)[17-18]，同時應(yīng)重視BV患者經(jīng)陰式婦科手術(shù)及宮腔鏡術(shù)前的針對性治療，進而降低術(shù)后發(fā)生感染的風(fēng)險。在計劃生育科，人工流產(chǎn)造成的子宮內(nèi)膜損傷導(dǎo)致陰道正常防御機制的破壞，更容易造成子宮內(nèi)膜慢性炎癥，因而在計劃生育術(shù)前對確診的BV進行針對性治療也非常重要。

BV相關(guān)GV混合感染類型以合并支原體、VVC、HPV感染最為常見。在合并支原體感染中，合并UU占36.10%，同時合并MH占30.74%，合并MH僅占8.39%。雖然合并UU比例最高，但未分型UU在健康人群中的攜帶率高達10%～30%，其臨床意義還需結(jié)合臨床表現(xiàn)綜合評判[19-20]。合并MH占比雖低，但有研究表明，MH感染可致產(chǎn)后發(fā)熱，與子宮內(nèi)膜炎及盆腔炎具有相關(guān)性[21-22]，因此，應(yīng)對合并MH感染患者應(yīng)及時進行針對性干預(yù)治療。GV產(chǎn)生唾液酸酶是生物膜形成中的重要步驟，而生物膜的形成可能是HPV感染持續(xù)存在的風(fēng)險因素[23-24]。以GV、擬桿菌、動彎桿菌、普雷沃菌屬等厭氧菌過度增殖而乳酸桿菌缺失造成的陰道微生物菌群的紊亂也增加了性傳播疾病易感風(fēng)險。因此，區(qū)分BV相關(guān)GV患者，并明確是否有MH、VVC、HPV及性傳播疾病等合并感染，在預(yù)防與針對性治療婦科相關(guān)感染性疾病中存在一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述，GV是BV相關(guān)致病菌中最主要的病原菌，陰道拭子普通培養(yǎng)法聯(lián)合革蘭染色Nugent評分不但可以區(qū)分出與BV相關(guān)GV及GV定植菌，而且還能作為GV鑒定失敗但以Nugent評分確認(rèn)BV陽性的補充手段。BV合并VVC、支原體、HPV感染及STD感染在臨床較為常見，因此，在進行生殖道疾病臨床診治時明確病原菌，區(qū)分是單純感染還是混合感染，將有助于臨床制訂針對性的綜合治療方案，合理選擇與使用抗菌藥物，進而避免因抗菌藥物濫用而產(chǎn)生的耐藥問題，也在一定程度上降低了患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。