紅曲廢渣發酵制備枯草芽孢桿菌微生態制劑

張 晨，王 揚，楊 新，潘丹丹，胡文林，時祥柱，陳炳鈿，羅春連，倪 莉,

（1.福州大學食品科學技術研究所，福建福州 350108；2.福建省食品生物技術創新工程技術研究中心，福建福州 350108；3.福州大學食品營養與健康研究中心，福建晉江 362251；4.廣東省天益生物科技有限公司，廣東湛江 524300；5.福建省新閩科生物科技開發有限公司，福建福州 350008；6.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建福州 350012；7.福建省工業產品生產許可證審查技術中心，福建福州 350013）

紅曲廢渣是紅曲霉液態發酵并經色素提取后剩余的殘渣，其中含有約40%碳水化合物、25%蛋白質、2.5%脂類以及少量的紅曲色素、麥角固醇和殼聚糖等活性物質[1?3]。充分挖掘紅曲廢渣的應用價值，符合我國發展可持續性食品產業的戰略。

我國每年紅曲廢渣的產量近萬噸[4?6]，但當前紅曲廢渣的開發應用較少，主要用于生產蛋白質飼料[7]或作為原材料提取莫納克林K和γ-氨基丁酸[8]等活性物質。然而，紅曲廢渣不易消化吸收，直接用于動物飼料時料肉比較低[7,9]；紅曲廢渣處理后仍保留大量營養物質，將其用于功能性物質提取，存在富營養污染的風險。相比之下，若以枯草芽孢桿菌發酵紅曲廢渣并將其制成微生態制劑，可充分利用紅曲廢渣中的營養成分，以實現廢棄物的綠色高效利用。一方面，枯草芽孢桿菌是國際公認的可直接添加在動物飼料中的益生菌[10?11]，具有調節機體胃腸道生態平衡[12?14]、促進生長[15?16]、增強機體免疫力[17?19]等多種功效，可用于制備具有保健功能的微生態制劑。另一方面，紅曲中的營養成分，包括碳水化合物與蛋白質，可被枯草芽孢桿菌降解、利用，并生成具有較強抗氧化性的代謝物質[20?22]。

為了充分利用紅曲廢渣，本研究將其作為原料，發酵制備枯草芽孢桿菌微生態制劑。通過單因素和響應面優化確定最佳發酵條件；測定發酵過程中可溶性糖含量的變化，分析枯草芽孢桿菌對紅曲廢渣中可溶性糖和蛋白質的利用情況；利用加速貯藏實驗評價微生態制劑中枯草芽孢桿菌活菌的儲藏穩定性；對微生態制劑中可溶性成分的抗氧化性進行評估（包括鐵還原力、DPPH自由基和羥自由基的清除能力）。為充分挖掘紅曲廢渣的價值，發展可持續性食品產業提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌（FZU.SWJS03） 福州大學食品科學技術研究所篩選獲得；紅曲廢渣 廣東省天益生物科技有限公司提供，干燥的紅曲廢渣經100目篩網后，4 ℃密封保存；D-木糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖 色譜純，源葉生物有限公司；甲醇 分析純，德國MERCK公司；其他分析純試劑 上海國藥集團化學試劑有限公司。

THZ-82型恒溫震蕩器 常州國華電器有限公司；XPN-100/90/80型高速冷凍離心機 貝克曼庫爾特儀器有限公司；LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海名元實業有限公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋 常州蒙特儀器制造有限公司；UV-2000型紫外可見分光光度計 上海一恒科學儀器有限公司；SH220F石墨消解儀 山東海能科學儀器有限公司；Agilent 6890 A高效氣相色譜儀 安捷倫有限公司；Kjeltec 8400 型全自動凱氏定氮儀 丹麥福斯集團公司。

1.2 枯草芽孢桿菌的發酵

1.2.1 枯草芽孢桿菌種子液的制備 配制普通液體培養基（蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L），用0.1 mol/L NaOH溶液將培養基的初始pH調節至7.2。在37 ℃下恒溫培養枯草芽孢桿菌12 h，使其達到指數生長期，然后將在枯草芽孢桿菌指數生長期的菌液離心并用無菌生理鹽水（9 g/L NaCl溶液）洗滌兩次。將重懸菌液的濃度調節至5 lg CFU/mL，制備枯草芽孢桿菌種子液。

1.2.2 單因素實驗 將紅曲廢渣和去離子水在250 mL三角燒瓶中充分混合后，在121 ℃下高壓滅菌20 min。固定接種量為3.0 mL種子液，以紅曲廢渣濃度100 g/L、枯草芽孢桿菌接種量10%、搖床轉速220 r/min、發酵時間48 h為固定參數，設計單因素實驗。依次改變發酵時間0、6、12、18、24、30、36、42、48 h、紅曲廢渣濃度50、75、100、125、150 g/L、枯草芽孢桿菌接種量5%、10%、15%、20%、25%、以及搖床轉速160、180、200、220、240 r/min，固定其他基本實驗條件，測定在37 ℃條件下對枯草芽孢桿菌生長的影響（活菌數的變化）。

1.2.3 響應面試驗 根據單因素實驗的結果和Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以枯草芽孢桿菌活菌數（Y）為響應值，以紅曲廢渣濃度（A）、枯草芽孢桿菌接種量（B）和搖床轉速（C）為自變量，設計三因素三水平的響應面分析試驗對發酵參數進行優化。每組試驗重復3次，結果取其平均值。試驗方案如表1所示。

表1 中心組合設計的因素水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken Design (BBD)

1.3 測定方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌活菌數 在無菌條件下準確量取1.0 mL待測樣，取1.0 mL發酵液依次進行10倍稀釋至合適倍數，平板涂布后進行恒溫培養，24 h后觀察計數。

1.3.2 可溶性蛋白測定 每隔6 h取發酵液，5000 r/min離心20 min，棄去沉淀，取上清液置于消化管中，加入3.0 g硫酸鉀、0.2 g硫酸銅和10.0 mL濃硫酸，然后在石墨消解儀中消化，待消化完全后，冷卻至室溫并在全自動凱氏定氮儀中進行消化，最后用稀鹽酸溶液滴定。實驗依據GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法和全自動凱氏定氮儀測定可溶性糖含量。

1.3.3 可溶性糖測定 每隔6 h取發酵液，5000 r/min離心20 min，棄去沉淀，取上清液按照GB 5009.7-2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》中的苯酚硫酸法進行測定。

1.3.4 單糖組成分析 每隔6 h取發酵液，5000 r/min離心20 min，棄去沉淀，取上清液于密封的玻璃管中，移入2.0 mL三氟乙酸溶液（TFA，2 mol/L），密封振蕩均勻，在120 ℃條件下水解5 h。反應結束后，利用氮吹儀吹干（水浴溫度設置為70 ℃），加入 3.0 mL色譜級甲醇重復若干次，直至除盡三氟乙酸為止，備用。

1.2.6 Western blot 將細胞用胰酶消化后用細胞裂解液裂解，離心后收集上清，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸8 min，用10% SDS-PAGE電泳后，在100 V恒壓條件下將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉移至PVDF膜上；將PVDF膜用含有0.2%Tween20的TBS緩沖液(TBST)洗滌后用含有5%脫脂奶粉的TBST 37 ℃封閉30 min；將第一抗體用TBST緩沖液稀釋后，與PVDF膜一同裝入雜交袋中，4 ℃過夜；TBST洗滌后將HRP標記的二抗與PVDF膜一同裝入新的雜交袋中，室溫搖床上放置30 min或者1 h；TBST緩沖液洗滌后進行ECL發光檢測。

分別稱量10.0 mg的阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰胞壁酸單糖于密封的玻璃管中，依次加入鹽酸羥胺10.0 mg， 內標物肌醇10.0 mg和吡啶1.0 mL，于90 ℃水浴鍋中振蕩反應30 min。反應結束冷卻，在相同條件下加入1.0 mL醋酸酐進行乙酰化，得到糖腈乙酸酯的衍生物。冷卻，加入適量的甲醇，70 ℃下氮吹，反復3～4次除去乙酸酐和吡啶?；旌蠁翁菢藴势罚ê鲉翁?.0 mg）與經三氟乙酸水解后的樣品均按上述步驟處理后加入1.5 mL色譜級甲醇溶解。將樣品經0.22 μm的有機微孔濾膜過濾后，注入色譜進樣瓶，通過氣相色譜以RTX-1701石英毛細管（0.25 μm×30.0 m）和氫火焰離子化檢測器（FID）分析單糖組分。程序升溫：180～220 ℃（5 ℃/min）， 220 ℃（5 min），220～280 ℃（10 ℃/min）；載氣：氮氣（1.0 mL/min）；進樣量：1.0 μL。以肌醇作為內標，通過各組分峰面積計算其含量。

1.3.5 儲藏穩定性 收集優化發酵后的枯草芽孢桿菌活菌制劑，將其初始濃度調整為4.1×109CFU/mL。參考朱征宇等的方法[23]，分別在30、37、50、60 ℃下對微生態制劑進行加速貯藏實驗，測定枯草芽孢桿菌活菌數以考察穩定性。微生物的失活速率與菌種特性所處的營養條件及溫度有關，其失活過程符合一級反應動力學?？杀硎緸椋?/p>

式中：N0表示初始活菌數，CFU/mL；Nt表示t時刻殘存活菌數，CFU/mL；k表示失活常數，h?1；t表示失活時間，h。

同時，不同溫度下的失活常數k與溫度T的動力學關系符合Arrhenius方程，其對數形式為：

可利用該公式計算不同溫度下的失活常數k。式中：A為Arrhenius常數（通過不同溫度條件下測定失活常數k并繪制擬合趨勢線，由其X軸截距=lgA計算而得）；E表示微生物失活所需的活化能，4.186 J/mol；R為摩爾氣體常數，8.314 J/mol·K；T表示溫度，K。

菌株的存活率可表示為：

1.3.6 抗氧化性 參考黃夢姣[24]測定鐵還原力、DPPH·和羥自由基（·OH）清除能力的方法，略作修改后測定枯草芽孢桿菌微生態制劑溶液的抗氧化性。將1.0 mL發酵液與10.0 mL 50%甲醇充分混勻，在25 ℃暗室中浸泡6 h后用濾紙過濾，將濾過液定容至10.0 mL備用。

1.3.6.1 鐵還原力 在1.0 mL不同體積濃度（20%、40%、60%、80%、100% ，v/v）的樣品（枯草芽孢桿菌微生態制劑的可溶性物質濃度分別為0.04、0.09、0.17、0.34、0.51、0.68、0.85 mg/mL）中加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.5）和2.5 mL 10 g/L鐵氰化鉀溶液并混合均勻，50 ℃恒溫水浴20 min。取出快速冷卻后，再加入2.5 mL 100 g/L 三氯乙酸溶液，并以3000 r/min離心10 min。取上清液加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 1 g/L FeCl3溶液靜置10 min后于700 nm處測定其吸光值。以鐵氰化鉀溶液當量（mmol/L）表示樣品的抗氧化能力，并將其抗氧化效果與0.1 mg/mL維生素C溶液進行對比。

1.3.6.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力 取1.0 mL不同體積濃度（20%、40%、60%、80%、100% ，v/v）的樣品（枯草芽孢桿菌微生態制劑的可溶性物質濃度分別為0.04、0.09、0.17、0.34、0.51、0.68、0.85 mg/mL）與2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH·醇溶液混合，避光孵育30 min后，于517 nm處測定其吸光值（AS1）。在同樣條件下，以樣品與等體積的無水乙醇混合作為樣品空白，測定其吸光值（AS0）；以2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH·醇溶液與等體積的無水乙醇混合作為對照，測定其吸光值（AC）。根據下列公式計算枯草芽孢桿菌微生態制劑溶液對DPPH·的清除率，并將其效果與0.1 mg/mL維生素C溶液進行對比。

式中：AS1、AS0、AC分別表示樣品、樣品空白、空白對照的吸光值。

1.3.6.3 羥自由基（·OH）清除能力 將1.0 mL 9 mmol/L FeSO4和1.0 mL 9 mmol/L水楊酸溶液混合后，分別加入0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mL樣品（枯草芽孢桿菌微生態制劑的可溶性物質濃度分別為0.04、0.09、0.17、0.34、0.51、0.68、0.85 mg/mL），再加入1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，于37 ℃下反應30 min后，在510 nm處測定其吸光值（AS1）。在同樣條件下，用1.0 mL蒸餾水代替H2O2溶液作為樣品空白，測定吸光值（AS0）；以1.0 mL蒸餾水代替樣品作為空白對照，測定其吸光值（AC）。根據下列公式計算待測枯草芽孢桿菌微生態制劑溶液對·OH的清除率，并將其效果與0.4 mg/mL維生素C溶液進行對比。

式中：AS1、AS0、AC分別表示樣品、樣品空白、空白對照的吸光值。

1.4 數據處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件對Box-Behnken中心組合試驗設計的結果進行數據處理，進行回歸模型的建立和單因素方差分析。若無特別說明，以上所有實驗數均重復3次，通過Excel計算平均值和標準偏差。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌發酵紅曲廢渣的單因素實驗

通過單因素實驗對枯草芽孢桿菌的生長條件進行分析，結果如圖1所示。圖1a顯示隨著發酵時間的增加，枯草芽孢桿菌發酵紅曲廢渣的活菌數呈現先上升后平穩的趨勢，在發酵30 h后基本進入平穩期，最大活菌數為8.8 lg CFU/mL。為保證發酵完全，在后續實驗中固定發酵時間為48 h。圖1b～d分別顯示紅曲廢渣濃度、枯草芽孢桿菌接種量以及搖床轉速對枯草芽孢桿菌生長量的影響，結果表明在這三個變量數值增大的過程中，枯草芽孢桿菌的活菌數均表現為先上升后下降的趨勢。紅曲廢渣在濃度為100 g/L時，活菌數達到最大值，為9.3 lg CFU/mL（圖1b）。紅曲廢渣濃度較低時，提高原料濃度可以為菌生長提供充足的碳源、氮源等營養物質；然而當其濃度過高時，培養基的流動性變差，傳質效率降低，進而使得枯草芽孢桿菌生長受限。當枯草芽孢桿菌的接種量為10%時，活菌數達到最大值，為9.2 lg CFU/mL（圖1c）。初始接種量小于10%時，會延長枯草芽孢桿菌增殖到峰值的時間；而初始接種量過大會使其快速吸收營養物質，迅速增殖導致溶氧量不足，反而使其增殖受限。當搖床轉速為220 r/min時，活菌數達到最大值9.3 lg CFU/mL（圖1d）。這是由于搖瓶里的溶氧量隨搖瓶轉速的提高而上升，較多的氧氣可以促進枯草芽孢桿菌增殖；而轉速過大時，枯草芽孢桿菌的流動過于劇烈反而造成菌體的死亡。為進一步優化發酵條件，選擇紅曲廢渣濃度為75～125 g/L，枯草芽孢桿菌接種量為5%～15%、搖床轉速為200～240 r/min進行后續響應面實驗設計。

圖1 發酵時間（a）、紅曲廢渣濃度（b）、枯草芽孢桿菌接種量（c）和搖床轉速（d）對枯草芽孢桿菌產量的影響Fig.1 Effects of fermentation time (a), Hongqu residue concentration (b), inoculation amount of Bacillus subtilis (c),shaker speed (d) on the yield of Bacillus subtilis

2.2 響應面優化枯草芽孢桿菌發酵紅曲廢渣條件

2.2.1 響應面試驗設計及結果 根據單因素實驗的結果，選擇紅曲廢渣濃度（A），接種量（B），搖床轉速（C）為自變量，以枯草芽孢桿菌的總活菌數為響應值（R），設計三因素三水平的響應面分析試驗，在17個不同試驗組合的條件下，試驗設計方案見表2。

使用Design-Expert 8.0軟件對表2實驗結果進行二次多項式回歸擬合和回歸方程的方差分析（表3），得到二次多項式回歸方程：

表2 枯草芽孢桿菌發酵紅曲廢渣的響應面試驗結果Table 2 Response surface test design of Hongqu residue fermented by Bacillus subtilis

回歸方程的決定系數R2為0.99，其方差分析（見表3）的顯著性檢驗表明，該回歸模型P<0.0001，方程模擬表現極顯著，失擬項P=0.0592>0.05，不顯著，模型擬合良好，可用于紅曲廢渣培養枯草芽孢桿菌工藝優化預測。其中紅曲廢渣濃度、搖床轉速對活菌數的影響均高度顯著，三種因素對活菌數影響的排序為紅曲廢渣濃度（A）>搖床轉速（C）>枯草芽孢桿菌接種量（B），并且一次項A、C，交互項AB、AC、BC，二次項A2、B2、C2對枯草芽孢桿菌總活菌數的影響極顯著（P<0.01）。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA of regression equation

2.2.2 交互作用分析 為了更為直觀的說明三種因素間的交互作用對枯草芽孢桿菌活菌數的影響，通過回歸方程繪制響應面的3D曲面圖和等高線圖，考察相應的擬合曲面。如圖2所示，三個參數兩兩間的3D曲面均開口向下且等高線均呈橢圓形，表明三種因素兩兩之間存在交互作用，且存在兩兩間的最適組合使得總活菌數最高；其中，接種量對活菌數的影響大于紅曲廢渣濃度，另外兩種因素的交互作用對活菌數的影響程度相近。

圖2 兩因素交互作用對響應值的影響Fig.2 Influence of interaction of two factors on response value

2.2.3 驗證實驗 通過響應面回歸模型及軟件分析得到最優發酵條件：紅曲廢渣濃度102 g/L，枯草芽孢桿菌接種量10%，搖床轉速為224 r/min，預測可獲得的最大活菌數為9.3 lg CFU/mL?？紤]到實際條件，將驗證實驗的發酵條件修正為紅曲廢渣濃度100 g/L，枯草芽孢桿菌接種量10%，搖床轉速220 r/min。在此條件下重復三次實驗，枯草芽孢桿菌的活菌數為（9.3±0.3） lg CFU/mL，與理論預測值基本一致，說明回歸模型可靠，模型的預測值能較好地反映發酵過程實際的活菌數。因此，對該菌株發酵條件的研究，可為其進一步放大乃至工業化生產提供理論基礎。

2.3 枯草芽孢桿菌生長過程中發酵液營養物質含量的變化

跟蹤發酵液中可溶性糖、可溶性蛋白質的含量和活菌數的變化的相關性分析影響枯草芽孢桿菌生長的關鍵成分，結果如圖3所示。在搖床轉速為220 r/min，37 ℃條件下，當發酵時間為30 h時，枯草芽孢桿菌的增長進入平穩期，可溶性糖和可溶性蛋白質的含量分別從2.40和2.50 g/L降低至0.24和0.70 g/L?？扇苄蕴堑南妮^大，推測其含量是枯草芽孢桿菌的生長的主要限制因素。為進一步分析枯草芽孢桿菌對營養物質具體單糖的利用情況，對發酵液中的單糖含量進行測定。結果表明，葡萄糖、甘露糖和半乳糖的含量與菌量的增加密切相關。從圖3可看出，當葡萄糖、甘露糖和半乳糖逐步被使用完時，其生長基本停止。葡萄糖是枯草芽孢桿菌優先使用的碳源，也是其增殖的關鍵。在發酵時間為6 h時，葡萄糖含量從0.96 g/L降低到0.73 g/L，甘露糖和半乳糖的含量基本沒有變化，此時菌量從5.0 lg CFU/mL增長到5.3 lg CFU/mL。發酵6～12 h的過程中，菌量增長了141倍，葡萄糖含量降低至0.23 g/L，而甘露糖和半乳糖的含量變化較小?？梢娬f明葡萄糖是限制枯草芽孢桿菌的生長的主要因素，可通過額外添加葡萄的含量，進一步提高紅曲廢渣的利用率。

圖3 發酵液可溶性糖、可溶性蛋白質和活菌數隨發酵時間的變化Fig.3 Variation of the amount of soluble sugar, soluble protein and viable bacteria during fermentation

2.4 枯草芽孢桿菌微生態制劑的儲藏穩定性分析

通過測定枯草芽孢桿菌微生態制劑在不同存放溫度下的活菌數變化，評估其儲藏穩定性，結果如圖4所示。不同溫度下，微生態制劑活菌數變化的擬合直線分別為：30 ℃，lgNt=?0.0009t+9.6，R2=0.88；37 ℃，lgNt=?0.0019t+9.6，R2=0.87；50 ℃，lgNt=?0.0035t+9.6，R2=0.98；60 ℃，lgNt=?0.0078t+9.6，R2=0.95。在四種不同的儲藏溫度條件下，枯草芽孢桿菌的活菌數均呈現下降趨勢，且下降幅度與溫度的增加有正相關性。初始濃度為9.6 lg CFU/mL的枯草芽孢桿菌在30、37、50和60 ℃下儲藏120 h后，枯草芽孢桿菌的存活率分別為75.6%、56.1%、36.6%和8.9%。利用圖4中的數據可進一步分析在其他溫度下，微生態制劑的儲藏穩定性。首先，通過公式（1）分別計算出不同溫度下的失活常數k（k30℃= 0.0020（h?1）、k37℃=0.0044（h?1）、k50℃= 0.0081（h?1）、k60℃= 0.0180（h?1））。然后，再根據公式（2）將k與溫度T作lgk-1/T圖，作線性回歸，可得回歸方程：lgk=?2960.2/T?7.1。根據此方程可計算出在常溫20 ℃條件下，微生態制劑的失活常數k20℃= 0.0010（h?1）。以此失活常數計算微生態制劑在20 ℃下保存三個月，微生態制劑的活菌數為8.7 lg CFU/mL，符合微生態制劑的活菌數要求[25?26]。

圖4 不同溫度對微生態制劑活菌數的影響Fig.4 Effects of different temperatures on viable cell count of microbioecologics

2.5 枯草芽孢桿菌微生態制劑的抗氧化性評估

將微生態制劑中的可溶性成分進行分離，并測定其抗氧化性，結果如圖5所示。結果表明枯草芽孢桿菌微生態制劑可溶性成分的鐵還原力、DPPH·和羥自由基的清除能力均與可溶性成分的濃度呈量效關系。微生態制劑具有一定的抗氧化能力，其中DPPH自由基清除能力最強。微生態制劑可溶性成分的鐵還原力為0.97 mmol/L，約為0.09維生素C當量（g/g），優于枯草芽孢桿菌N2?10（0.59 mmol/L）[27]；DPPH自由基清除能力為0.25 mg/mL（IC50），約為0.08維生素C當量（g/g）；羥自由基清除能力為0.69 mg/mL（IC50），約為0.23維生素C當量（g/g）（圖5a～5c）。可見，通過紅曲廢渣制備的枯草芽孢桿菌微生態制劑具有較強的抗氧化能力。尤其是在DPPH自由基的清除能力方面，可有效減輕自由基對機體的損傷，維持機體健康。其原因一方面可能是由于紅曲廢渣中含有的色素、多糖、酚類等多種抗氧化成分[28]，另一方面可能是枯草芽孢桿菌代謝過程中產生的抗氧化活性肽[20?21,29?30]等成分共同作用的結果。

圖5 枯草芽孢桿菌微生態制劑的抗氧化性Fig.5 Antioxidant activity of Bacillus subtilis microbioecologics

3 結論

以紅曲廢渣為原料制備枯草芽孢桿菌微生態制劑，通過單因素實驗和響應面分析得到的最優的發酵條件為發酵時間48 h，紅曲廢渣濃度100 g/L，枯草芽孢桿菌接種量10%，搖床轉速220 r/min，枯草芽孢桿菌的最大產量為（9.3±0.3）lg CFU/mL。該體系中可溶性糖是限制枯草芽孢桿菌生長的主要因素。枯草芽孢桿菌先利用葡萄糖，后利用甘露糖和半乳糖作為其生產所需的碳源。且該法獲得的枯草芽孢桿菌微生態制劑穩定性較高，在常溫下存放三個月后的活菌數為8.7 lg CFU/mL高于微生態制劑的應用要求。所得微生態制劑具有較強的抗氧化性，其可溶性成分的鐵還原力為0.97 mmol/gL，約為0.09維生素C當量（g/g）；DPPH自由基清除能力0.25 mg/mL（IC50），約為0.08維生素C當量（g/g）；羥自由基清除能力為0.69 mg/mL（IC50），約為0.23維生素C當量（g/g）。本研究證明紅曲廢渣可作為原料制備枯草芽孢桿菌微生態制劑，為微生物發酵廢渣的可持續性綠色加工提供了實踐依據。