HS-SPME-GC-MS結合多元統計分析初榨椰子油常溫儲藏過程中揮發性風味成分

石 芬，徐 軍，姜宗伯，白新鵬,, ，黃 歡，陳 星

（1.海南大學食品科學與工程學院，海南海口 570228；2.熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心，海南海口 570228；3.海南大白康健醫藥股份有限公司，海南海口 570000）

椰子主要分布在熱帶或亞熱帶沿海地區，是與茶、橄欖和棕櫚并列的四大木本油料植物之一[1]。椰子油（Coconut oil，CO）作為椰子的主要成分，其通常分為兩大類：初榨椰子油（Virgin coconut oil, VCO）和精制椰子油（Refined, bleached, deodorized coconut oil, RBD）。VCO是通過機械或自然過程從新鮮成熟的椰子肉中獲得的，無需任何精煉步驟，從而保留了椰子的各種自然特性[2]和更多的生物活性成分[3]，賦予其更多的生理功能[4]。此外，由于富含天然揮發性化合物，VCO味道清香與牛奶相似，受到廣大消費者的青睞。

VCO儲藏過程中受溫度、光照、空氣和金屬離子等影響，在存放初期也會產生令人不愉悅的氣滋味而影響消費者的食用喜好，并對油品質產生一定的影響。脂質氧化酸敗過程中，除了導致脂肪酸和微量有益成分含量減少、營養品質下降外[5]，在氧化中后期還會產生一系列有害成分，包括氫過氧化物等初級氧化產物和小分子的醛、酮、烷烴和烯醛等一些主要的揮發性次級氧化產物[6]，對食用油的氣味具有重要影響作用。揮發性成分組成與含量的不同，將導致油脂風味特性出現差異，新鮮油整體呈一定的香氣，氧化油脂則呈現一定的酸敗味[7?8]。

目前，氣相色譜-質譜聯用（Gas chromatographymass spectrometry, GC-MS）被廣泛應用于食品揮發性成分分析的檢測，具有所需樣品少、分析速度快、靈敏度高等特性，并可以檢測出特定的風味化合物。楊朝暉等[9]采用SPME-GC-MS（Solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry）技術分析核桃油氧化的揮發性成分，己醛、正戊醇、戊醛和壬醛為主要的風味物質，戊醛含量隨著油脂氧化程度成正比。Escuderos 等[10]采取HS-SPMEGC-MS 方法對初榨橄欖油 100 ℃下加速氧化 33 h期間壬醛含量的變化進行研究，發現壬醛可作為評價初榨橄欖油氧化程度的評價指標。Petersen等[11]采用頂空固相微萃取氣相色譜法（HS-SPME-GC）對熱應激常規油和高油酸向日葵（HOSF）油樣品在80 ℃下加速儲存14 d中選擇了六種揮發性化合物作為評估向日葵油（SF）和HOSF油脂質氧化的標記化合物。有研究表明[12]，油在室溫下的氧化過程與在較高溫度下引起的加速氧化過程存在差異，且目前國內外對椰子油常溫氧化過程的相關研究并不多見，關于VCO在常溫儲藏過程中的風味物質的變化情況還未見報道。

為了探究VCO在儲藏過程中揮發性成分的變化規律及其對油脂氧化過程中風味的影響，本研究采用頂空固相微萃取技術（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）與氣相色譜-質譜（GCMS）聯用技術，利用相對活度氣味值（Relative Odor Activity Value, ROAV）法并結合主成分分析（principal component analysis, PCA）及偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis, PLSDA ），以期確定常溫氧化過程中VCO的主體揮發性風味成分，探討不同常溫貯藏期風味成分的變化趨勢，為科學控制油脂氧化酸敗，提高VCO氧化過程中的品質提供理論及數據參考。本研究也為開發VCO氧化程度鑒別技術提供了潛在的方法和進一步的數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料 新鮮椰蓉（含水量3%），以及多年常溫保存的不同時期VCO樣品由海口植之素生物資源研究所有限公司提供。

SUN螺旋榨油機 廣州市揚光機械設備有限公司； 7890B 氣相色譜質譜聯用儀 美國Agilent公司；1cm × 65 μm PDMS萃取頭 Supelco USA。

1.2 實驗方法

1.2.1 椰子油制備及準備 采用螺旋榨油機在室溫下榨取，過濾即可得VCO，于室溫自然光下貯藏并定期取樣分析。VCO樣品儲藏期共計六年。本實驗主要分析測定的VCO樣品共計13組，取樣的8個時期展開如下：新鮮（0 d：1號）、半個月（15 d：2-1、2-2號）、半年（6 m：3-1、3-2、3-3號）、一年半（18 m：4-1、4-2、4-3號）、兩年半（30 m：5號）、三年半（42 m：6號）、四年半（54 m：7號）、五年半（66 m：8號）。其中2號有兩組、3號和4號各有三組同一儲藏時的不同樣品，其中4號樣品處于市售VCO的保質期，實驗測定均平行 3 次。

1.2.2 椰子油揮發性成分HS-SPME-GC-MS檢測 HS-SPME條件：參考Chang等[13]的方法，使用固相微萃取裝置（Supelco，Bellefonte，PA，USA）結合聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯纖維（長度 1 cm × 65 μm 膜厚）。將 5 g 油加入一個 20 mL 玻璃小瓶中，該小瓶帶有磁性螺旋蓋和聚四氟乙烯內襯橡膠隔墊。在充分攪拌下讓樣品在 55 ℃下平衡 10 min后，通過將帶有纖維的手動 SPME 支架插入小瓶中，在 55 ℃下萃取揮發物 30 min。隨后，通過將光纖置于氣相色譜儀入口，以不分流模式在 250 ℃下進行 3 min的熱解吸，以實現所有分析物的熱解吸。

GC條件：HP-5MS 彈性石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度：200 ℃，以氦氣為載氣，載氣流速：1.00 mL/min，色譜柱升溫程序：起始溫度 40 ℃，以 5 ℃/min 升至 300 ℃；進樣方式為不分流進樣。

MS條件：采用EI離子化方式，離子源溫度230 ℃，電子能量 70 eV，質量掃描范圍29～500 m/z。

1.2.3 化合物識別 人工解析圖譜，將獲得的質譜與NIST譜庫檢索匹配，進行化合物鑒定。僅選匹配度大于80%（最大為100）的鑒定結果，并與其他參考文獻[13?14]進行對比分析，采用面積歸一化法得到各揮發性成分的相對含量。

1.2.4 主體風味成分評價方法 基于相對氣味活度值（ROAV 法）評價各揮發性成分在VCO的氧化階段對其整體氣味的貢獻[15]，當ROAV≥1時，該物質可能對食品風味的貢獻和影響較大，為所測樣品的主體揮發性成分；0.1≤ROAV<1的組分對所測樣品的總體風味起重要修飾作用[16?17]；ROAV<0.1，表明該物質對總體風味無實質性貢獻，一般認為，ROAV 越大則說明該組分對樣品總體風味的貢獻越大。

1.3 數據處理

平行實驗數據均表示為平均值，采用Microsoft Office Excel 2016進行原始數據處理；SPSS Statistics 23、Origin 9.1、TB tools、Metabo Analyst 5.0進行作圖及相關分析，其中使用TB tools軟件繪制聚類熱圖，Metabo Analyst 5.0軟件用于PCA和PLS-DA。

2 結果與分析

2.1 儲藏期間初榨椰子油揮發性風味成分解析

通過HS-SPME-GC-MS檢測，VCO在室溫儲藏過程中共檢測到40種主要的揮發性成分（8個共有組分），包括酯類6種、醛類8 種、酮類 5種、酸類4種、醇類3種、烴類 4 種。其中在儲藏期為0 d、15 d、6 m、18 m、30 m、42 m、54 m和66 m，VCO分別有16、20、23、18、17、26、24和20種主要的揮發性成分。在VCO氧化過程中，受光、熱、氧等的影響，所產生的氫過氧化物易發生復雜的裂解和相互作用，生成醛、酮、酸等物質，這些小分子氧化揮發物影響著油脂的整體風味[5?6]。有研究表明，油脂氧化過程中產生具有基因毒性及細胞毒性的α/β不飽和醛類化合物，對人體健康產生危害[18]。如表1所示，分析可知酯類化合物是VCO整個儲藏過程中揮發性風味成分的重要組成部分，相對含量在27.29%～75.28%之間。此外，酮類化合物含量在6 m時達到最大（44.24%），成為此時期最主要的揮發性組分；酸類化合物先降低至消失（18 m）后又逐漸增大，成為含量最大的揮發性組分（30 m以后均達到50%以上），醛類化合物含量則在42 m時達到最大（8.09%）。由此可見，在VCO的氧化過程中產生的主要揮發物類別及含量存在顯著差異。

表1 VCO儲藏過程中揮發性風味成分比較Table 1 Comparison of volatile flavor components of virgin coconut oil during storage

圖1 是VCO儲藏過程中揮發性風味成分總含量分布熱圖。熱圖能夠將 GC-MS 分析得到的揮發性風味成分數據可視化[19]，圖1中紅色代表同種物質在某一樣品中的含量高，藍色則代表該物質在對應樣品中的含量低[20]，可以看出，長達六年的儲藏期間VCO特征風味成分的含量有明顯變化趨勢，且存在明顯差異。新鮮VCO中丁位辛內酯、丁位癸內酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、壬醛等揮發性風味成分的含量相對較高；2-庚酮在短時期內從無到有且快速增加，六個月（6 m）后成為最大的揮發性風味成分。己酮、2-十一酮、丁位己內酯、丁位辛內酯、辛酸甲酯、丁位癸內酯在一年半（18 m：市售油保質期）時的含量均達到最高，值得注意的是此時己酸、辛酸未檢出，推測己酸可能轉化為丁位己內酯和己酮；辛酸可能向丁位辛內酯、辛酸甲酯等轉化。己酸和辛酸在儲藏過程中有著先減小后增大的變化趨勢，在兩年半（30 m）和三年半（42 m）時分別成為最主要的揮發性風味成分，對椰子油風味有著重要的影響。

圖1 VCO GC-MS測定結果熱圖Fig.1 Heatmap of virgin coconut oil measured by GC-MS

2.2 不同類別化合物的含量與儲藏期關聯分析

PCA 分析利用降維思想，在損失很少信息的前提下將原來的眾多變量通過降低數據維數、除噪轉化為幾個綜合指標用于反映原來變量的信息，具有更優越的性能[21?22]。為進一步明確不同類別化合物的含量與儲藏期的相關性，結合HS-SPME-GC-MS的相關數據（表1），采用 Metabo Analyst 進行分析，繪制樣品PCA得分圖（圖2a）。由圖2a可知，可將不同時期的VCO樣品分為四組：A組：半月之內；B組：半年左右；C組：一年半左右；D組：兩年半至五年半。且各組之間分離分類的效果較好，無重疊區域，表明室溫儲藏的自然氧化過程明顯改變了VCO中各揮發性組分的含量。PCA載荷圖如圖2b所示，載荷反應了PCA中各變量與主成分之間的關系，由酯類化合物、酸類化合物和酮類化合物所處分布區域可知這三類化合物的含量可以為簡單區分不同儲藏期的VCO提供參考。圖2c中PLS-DA模型獲得的3D得分圖結果與PCA分布相似，VCO樣品被有效分為四類。圖2d是PLS-DA的模型參數，以驗證模型的有效性。模型參數第三組分的準確度值、R2值接近于1，Q2>0.9，表明模型具有較高的預測能力。

圖2 VCO氧化過程中揮發物類別含量的多元分析Fig.2 Multivariate analysis of volatile species content in the oxidation process of virgin coconut oil

2.3 VCO特征風味成分的分析

根據 Guadagni 氣味活度值理論，食品中香氣濃度高而閾值低的成分很可能是食品的特征香氣[23]，物質濃度高不一定對椰子油的香氣有很大的貢獻，而含量低的物質也有可能對椰子油的整體香氣有大的影響。因此，化合物的閾值對于初榨椰子油的風味分析至關重要，若知道這些揮發物的濃度和閾值，則可以有效判斷其在體系中對風味或味覺重要性的貢獻率[24]。

參考《化合物香味閾值匯編（第二版）》[23]及參考文獻[19,25?26]，確定了 24 種揮發性風味物質在部分或所有VCO樣品中 ROAV>0.1。一般認為ROAV≥1的組分為所分析樣品的關鍵風味化合物，0.1≤ROAV<1的組分對樣品的總體風味具有重要的修飾作用[15]。

其ROAV值、閾值及嗅聞氣味描述如表2 所示，其組成成分主要包括酯類、酸類、醛酮類，另外還有少部分醇類。可以看出，從C11（壬醛）、C15（辛酸乙酯）、C17（丁位辛內酯）、C18（2-十一酮）、C21（癸酸乙酯）、C22（丁位癸內酯）和C23（月桂酸乙酯）這7種風味物質在各氧化期間均有不同影響程度的存在，這些化合物的綜合作用賦予VCO獨特的奶油香及果香氣味，其中C17（丁位辛內酯）、C21（癸酸乙酯）和C22（丁位癸內酯）具有獨特的椰子香型和乳脂似香氣。已有研究證明丁位辛內酯可產生明顯的椰子氣味[27]。C11（壬醛）雖在VCO中的濃度并不高但因其閾值低，使之也成為椰子油的特征香氣物質，賦予其蜜蠟花香氣息。此外，C3（2-庚酮）在鮮榨VCO中未檢出，隨后其ROAV有著先增大后降低的趨勢，類似趨勢的還有C9（丁位己內酯），其在18 m以前的ROAV均>1，意味著這些化合物是VCO氧化前中期的重要特征風味物質，且都隨著氧化時間的進一步延長ROAV降低，甚至消失。這些物質對VCO的整體香氣及差異區分起到很大的貢獻作用，其余關鍵風味成分有著重要修飾作用。而C2（己醛）、C4（反式-2-庚醛）、C5（己酸）、C14（辛酸）、C15（辛酸乙酯）以及C16（2-癸烯醛）等揮發物在30 m以后的ROAV值明顯增大，成為VCO氧化后期的關鍵特征風味物質，并賦予椰子油明顯的酸敗味及其他略有不舒適的氣味或刺激味。有研究表明，戊醛、己醛、反式-2-庚醛等關鍵風味化合物是油酸和亞油酸的氧化降解產物[28]。

綜上，相對氣味活度值（Relative odor activity value, ROAV）的分析表明己醛、2-庚酮、丁位己內酯、壬醛、辛酸乙酯、丁位辛內酯、2-十一酮、癸酸乙酯、丁位癸內酯等是初榨椰子油常溫儲藏過程中關鍵風味物質。整體上酯類化合物是賦予VCO獨特的椰香的來源，而C3（2-庚酮）和C7（己酮）等酮類化合物在氧化前期（6 m）的產生和大量增多對VCO的清香氣味有著一定的刺激作用，使得VCO的風味變化極為迅速，隨后則是醛、酸類化合物的綜合作用導致VCO出現更多的不良風味。因此，不同氧化階段產生的揮發性風味物質對VCO的風味有著重要的影響，其部分特征揮發物產生的不良風味對VCO的整體風味也有著至關重要的作用。

2.4 特征風味物質與儲藏期關聯分析

為在降維中可視化數據結構，通過歸一化處理了表2中具有變化規律的特征揮發性成分的ROAV生成PCA得分圖（圖3）。根據PCA分類結果（圖3a）可見，不同時期VCO樣品分成了四組，與上述不同類別化合物含量與儲藏期關聯分析所得分組相同，結合儲藏期可將本研究涉及的VCO樣品的氧化過程大致分為四個階段：A組：半月之內（0～15 d），新鮮油；B組：半年（6 m），氧化前期；C組：一年半（18 m），氧化中期；D組：兩年半至五年半（30～66 m），氧化后期。如圖3a所示， B組（綠點）和C組（紫點）之間觀察到存在部分重疊，而A組（紅點）、D組（藍點）明顯遠離其他兩組。這意味著氧化過程明顯改變了椰子油的揮發性成分，VCO在市售保質期內揮發性風味物質存在一定的共性，但隨著儲藏期的延長由各別特征風味物質的出現逐漸轉變為大量不良風味物質的產生。因此，貯藏期對分類影響較大，不同時期的氧化反應是VCO特征揮發物質差異的重要因素。

表2 VCO儲藏過程中揮發性風味成分相對氣味活度值Table 2 Relative odor activity of volatile flavor components in VCO during storage

PLS-DA 作為一種有監督的判別分析統計方法[29]，與PCA側重反映樣品的分類趨勢不同的是PLSDA可用于建立揮發性風味物質與樣品類別的關聯模型，以實現樣品類別預測[30]。ROAV的PLS-DA三維得分示意圖如圖3c所示，Component 1 貢獻率為 46.1%，Component 2 貢獻率為 19.9%，Component 3 貢獻率為 18.1%。由圖可直觀反映各樣本間的相似性和差異性，兩個樣本間差異越大，表現在得分圖上的相對位置越遠，反之亦然[25]。這些樣品的歸類結果與VCO所處的氧化階段直接相關，PLS-DA 建立的關系模型也將VCO樣品分為四類。圖3d中列出了PLS-DA的模型參數，R2為0.95，Q2>0.8，表明模型具有較高的預測能力，模型有效。

變量投影重要度（variable importance for the projection, VIP）可以用來衡量PLS-DA 模型下每一個變量因子的表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，從而輔助標志變量因子的篩選[31]。如圖3e所示，VIP 值越大，表明該風味物質在組間的差異越大，對VCO氧化程度的判別分類越關鍵。依據 VIP 值>1.0 的原則并結合PCA的載荷圖（圖3b），共篩選出2-庚酮、己醛、丁位己內酯、丁位辛內酯、2-癸烯醛、癸酸乙酯、己酮、己酸等關鍵差異性化合物，可將2-庚酮作為氧化前期（儲藏半年），己酮、丁位己內酯作為氧化中期（儲藏一年半），己醛、己酸、2-癸烯醛作為氧化后期 （儲藏兩年半至五年半）的重要特征揮發性風味成分。

圖3 VCO特征風味物質ROAV的多元分析Fig.3 Multivariate analysis of characteristic volatiles of VCO

圖4是VCO樣品中24種特征揮發性風味成分ROAV的分布熱圖。圖中紅色越深代表某種物質的風味貢獻程度越高，可以看出，不同儲藏時期的VCO都有明顯的特征揮發性成分，聚類分析結果也進一步表明氧化過程中存在明顯的變化趨勢。C10（2-壬醇）與C11（壬醛）具有甜而青的花蠟和果香的脂蠟香氣，對新鮮VCO的清香風味有著重要作用；同時C19（癸酸甲酯）、C21（癸酸乙酯）、C22（丁位癸內酯）、C24（δ-十二內酯）這些酯類化合物具有具有強烈持久的奶油香、脂肪香及椰子香型香氣，賦予新鮮VCO特殊的椰香味。在氧化前期C3（2-庚酮）對椰子油的風味影響較大，呈香蕉香氣及輕微藥香氣味，此外，C6（丁酸丁酯）、C9（丁位辛內酯）、C17（丁位辛內酯）、C23（月桂酸乙酯）等酯類揮發性化合物在氧化階段的前中期（18個月的保質期之內）也賦予乳脂似香氣及特殊的焦香、果香氣味，在氧化后期的影響作用則明顯降低，此階段C5（己酸）的酸敗味逐漸浮出；隨后C1（戊醛）、C2（己醛）、C4（2-庚醛（E）-）的木屑味、刺激味、魚腥味也開始起到不良作用；隨著氧化過程的不斷進行，呈脂肪和肉類香氣的C8（2-辛烯醛（E）-）、C16（2-癸烯醛, （E）-）有著重要修飾作用；伴隨著還有C14（辛酸）、C15（辛酸乙酯）、C20（癸酸）等揮發出的略有不舒適的油脂氣味和干酪味。

圖4 VCO樣品ROAV的分布熱圖Fig.4 Heat map display of ROAV in virgin coconut oil samples

雖然VCO樣品中主要揮發性風味成分大體相似，但是風味成分的含量及閾值的區別導致不同儲藏期的VCO樣品風味差異很大，關鍵風味物質的分析對VCO氧化過程中的風味及歸類至關重要，因此本研究對儲藏過程中揮發性風味成分的連續分析，充分揭示了不同氧化階段VCO樣品風味成分的貢獻程度及香氣差異的重要來源。綜上所述，通過脂質氧化中揮發性化合物的HS-SPME-GC-MS分析和多元統計方法相結合，可為鑒別不同新鮮程度VCO提供一種靈敏的有效工具。

3 結論

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（Headspace solid-phase microextraction–gas chromatography–mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯用技術對為期六年內8個時期的室溫儲藏過程中VCO中揮發性風味成分進行了分析，鑒定了40種揮發性物質，并計算ROAV確定VCO的24種特征風味成分，分析表明：整體上丁位辛內酯、癸酸乙酯和丁位癸內酯等酯類化合物是賦予VCO獨特的椰香的來源，而2-庚酮和己酮等酮類化合物在氧化前期的產生和大量增多對VCO的清香氣味有著一定的刺激作用，使得VCO的風味變化極為迅速，隨后則是醛、酸類化合物的綜合作用導致VCO出現明顯的酸敗味及其他不良風味。探究氧化過程中風味差異的產生來源也為VCO風味品質評價提供了理論參考。經PCA和PLS-DA分析，建立了VCO不同儲藏時期的判別模型，不同類別化合物（酮類化合物、酯類化合物和酸類化合物）的含量可以作為簡單區分VCO儲藏期的指標，同時篩選出2-庚酮、己醛、丁位己內酯、丁位辛內酯、2-癸烯醛、癸酸乙酯、己酮、己酸等關鍵差異風味物質也對VCO的氧化情況的判別有著重要參考作用，揮發性成分有可能作為監測VCO在儲藏過程中氧化程度的有效標志。通過HS-SPME-GC-MS結合適當的多元分析對VCO揮發性風味成分進行表征和分類，有可能被用作評估VCO品質的非破壞性方法。關于不同產地椰子制取的VCO的風味類型存在的其他差異還有待對比研究，延緩或抑制VCO自然氧化過程中不良風味產生的方法也可進一步深入探究。