山西毛建茶水提物解酒保肝作用研究

李會芳，郎 霞，程生輝，王智深

（山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西晉中 030619）

毛建草（Dracocephalum rupestreHance）[1]又名巖青蘭、毛尖，是唇形科青蘭屬植物，生長于海拔650～2400米的高山草原、草坡或疏林下陽處，為中國特有植物品種，主要分布在山西、遼寧、河北、內蒙古、青海等地。山西蘆芽山附近的百姓稱其為“毛尖茶”，自古便有將其制茶飲用的習俗。李慧卿等[2]研究表明毛建草干草中茶多酚含量達到21%；而馬江媛等[3]研究表明毛建茶中茶多酚含量為僅為4.579%，而兩者研究均表明咖啡堿含量低于其他普通茶品含量，分別為0.622%和0.495%[2?3]。毛建草全草具有較高的藥用價值，《中藥大辭典》明確其具有清熱消炎、涼血止血的作用，主治外感風熱、頭痛寒熱、喉痛咳嗽、黃疸性肝炎、吐血衄血、痢疾[4]。丁聰等[5]研究表明毛建草中主要含有黃酮類化合物，如北美圣草素、木犀草素、柚皮素-7-0-β-D-葡萄糖苷等，還含有熊果酸、白樺脂酸、間羥基苯甲酸等有機酸類及Ca、Mg、Fe等微量元素，具有心肌保護[6?7]、抗氧化[8?9]、抗血小板聚集[10]、降血脂[11]等活性。目前對毛建茶（草）的活性成分和活性評價研究都較薄弱，限制了其進一步的開發利用。

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是指因短期大量飲酒或長期酗酒造成的肝臟中毒性病理性損害，早期表現為肝細胞脂肪變性，進而發展為酒精性肝炎，最終導致肝纖維化和酒精性肝硬化[12]，嚴重者最終甚至可能惡化為肝癌，對人們的身心健康造成嚴重危害。臨床主要特征為惡心、嘔吐、乏力、黃疸并伴有肝臟腫大和壓痛[13]。初期主要特征是肝細胞中甘油三酯（TG）累積；中期是短期內肝細胞大量壞死引起的一組臨床病理綜合征，可發生于有或無肝硬化的基礎上；后期是由活化的肝星狀細胞產生的細胞外基質蛋白（例如膠原）的積累[14]。在中國，酒精性肝病的發病率逐年上升，其危害僅次于病毒性肝炎[15]。Zhu等[16]報道毛建草提取物對CCl4致肝損傷小鼠具有一定的保護作用，毛建茶對酒精性肝損傷是否具有保護作用未見研究報道。因此，本文擬采用醉酒模型和慢性酒精性肝損傷模型對毛建茶的解酒保肝作用進行研究，為毛建茶的進一步開發利用和市場推廣提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛建茶 山西省神池縣某毛建茶加工廠；鹽酸納洛酮注射液 海南靈康制藥有限公司（批號：190101112）；東寶肝泰片 通化東寶藥業股份有限公司（批號：180113）；清潔級昆明種小鼠（雌雄各半，體重：18～20 g） 山西醫科大學驗動物中心，動物合格證號-SCXK（晉）2015-0001；SPF級SD大鼠（雌雄各半，體重：180～220 g） 山西醫科大學動物中心，合格證編號：20180006003154；谷氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧酶（SOD）、還原性谷胱甘肽（GSH）、BCA蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所。

DNM-9602酶標分析儀 北京普朗新技術有限公司；Eclipse ci顯微鏡、Digital sight DS-FI2成像系統 日本NIKON公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 毛建茶水提物的制備 毛建茶1 kg用10倍量水浸泡1 h后，煎煮1 h后濾取茶液，第二次煎煮加8倍量水后煎煮1 h，合并2次茶液，濃縮至0.3 g/mL，置于4 ℃冰箱中保存待用。實驗過程毛建茶水提物（文中簡稱毛建茶）高、中、低劑量組灌胃濃度分別為0.3、0.15、0.075 g/mL。

1.2.2 毛建茶解酒作用研究

1.2.2.1 動物分組與給藥 昆明小鼠50只飼養于山西中醫藥大學普通環境動物房中，動物實驗方案獲得山西中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，適應性喂養7 d后隨機分為醉酒模型組（D-M）、鹽酸納洛酮組（NH）和毛建茶高劑量組（MJ-H）、中劑量組（MJM）、低劑量組（MJ-L），鹽酸納洛酮組腹腔注射鹽酸納洛酮注射液（0.002 g/kg），毛建茶高、中、低劑量組分別灌胃給予毛建茶水提物3、1.5、0.75 g/kg。

1.2.2.2 醉酒小鼠醉酒時間、醒酒時間的測定 各組提前禁食16 h，毛建茶組按給藥劑量單次灌胃后2 h（醉酒模型組灌服蒸餾水），參考文獻中醉酒模型的造模方法[17?18]，各組灌胃給予50%酒精（20 mL/kg）以造成醉酒模型，鹽酸納洛酮組先給予50%酒精30 min后腹腔注射給予鹽酸納洛酮注射液，觀察并記錄各組醉酒小鼠醉酒時間（小鼠給予酒精開始到小鼠出現翻正反射消失所用的時間）和醒酒時間（小鼠翻正反射消失直到小鼠再次恢復所消耗的時間）。灌酒后令小鼠呈仰臥位，若保持背部朝下的姿勢30 s以上，即認為翻正反射消失，則認為其醉酒；醉酒后，經過一段時間若翻正反射恢復，則認為其醒酒。

1.2.3 毛建茶對慢性酒精性肝損傷大鼠的保肝作用研究

1.2.3.1 動物造模分組與給藥 60只SD大鼠飼養于山西中醫藥大學普通環境動物房中，動物實驗方案獲得山西中醫藥實驗動物倫理委員會批準，適應性喂養7 d后隨機分成6組：空白組（CON）、慢性酒精性肝損傷模型組（ALI-M）、東寶肝泰組（DBGT, 東寶肝泰片0.36 g/kg）、毛建茶高劑量組（MJ-H, 3 g/kg）、毛建茶中劑量組（MJ-M, 1.5 g/kg）、毛建茶低劑量組（MJ-L, 0.75 g/kg）。各組大鼠上午以濃度為50%酒精1 mL/100 g灌胃，連續6周以造成慢性酒精性肝損傷模型[19]，空白組給予等體積蒸餾水。各給藥組下午按1 mL/100 g分別灌胃給藥，連續灌胃6周，每周稱重2次，根據體重調整各組給酒量和給藥量，空白組和模型組下午喂以同體積蒸餾水。

1.2.3.2 血清生化指標ALT、AST、TC、TG的檢測 實驗第6周結束，大鼠禁食不禁水12 h，末次給藥1 h后，10%水合氯醛麻醉后腹主動脈取血，將全血注入空白潔凈試管內，離心后（3000 r/min，15 min，4 ℃）分離血清，?80 °C凍存待檢血清。根據試劑盒說明書，采用酶標儀測定血清中ALT、AST、TC、TG的含量。

1.2.3.3 肝組織中MDA、SOD、GSH的檢測 末次給藥1 h后，麻醉大鼠采血后，摘取肝臟，稱取0.5 g肝組織于液氮中保存，制備肝勻漿后，蛋白定量后按試劑盒說明書操作，測定MDA、SOD、GSH的含量。

1.2.3.4 肝臟病理形態學觀察 末次給藥1 h后，腹主動脈取血后摘取每只大鼠的肝臟，置于10%中性福爾馬林中固定，常規取材，脫水，包埋，制片，H&E染色后，在光學顯微鏡下觀察。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 毛建茶對醉酒小鼠醉酒時間、醒酒時間的影響

實驗過程中D-M組在給予酒精后1.5 h內10只小鼠翻正反射全部消失，并持續至7 h以上，醉酒模型造模成功。如表1所示，與D-M組比較，NH組、MJ-H組、MJ-M組、MJ-L組小鼠的醉酒時間有延長的趨勢，但無顯著差異（P>0.05）；NH組及MJ-H組、MJ-M組、MJ-L組醒酒時間均極顯著縮短（P<0.01），并存在一定的劑量依賴關系。與D-M組相比，毛建茶高、中、低劑量組醒酒時間分別減少了50.80%、47.04%、46.01%，毛建茶能夠極顯著縮短醉酒小鼠的醒酒時間（P<0.01），具有一定的解酒作用，以高劑量組解酒作用最佳。

表1 毛建茶對小鼠醉酒時間、醒酒時間的影響 （n=10）Table 1 Effect of Maojian tea on the ebriety time and the sober time in mice (n=10)

2.2 毛建茶對慢性酒精性肝損傷大鼠血清中ALT、AST、TC、TG的影響

正常肝細胞內ALT、AST主要分布在肝細胞質和線粒體中，當肝細胞發生損傷后，胞內的ALT、AST會透過細胞膜流入血液中，因此，血清中ALT、AST的活性高低常用以反映肝細胞損傷程度[20]。如圖1所示，與CON組相比，ALI-M組大鼠血清中的ALT和AST水平顯著升高（P<0.05），慢性酒精性肝損傷模型造模成功；與ALI-M組相比，DBGT組及MJ-H組、MJ-L組大鼠血清中的ALT水平有降低趨勢，但無顯著差異（P>0.05）；MJ-M組ALT水平顯著降低（P<0.05）；DBGT組及MJ-H組、MJ-M組、MJL組大鼠血清中的AST水平均極顯著降低（P<0.01）。毛建茶低劑量組降低AST作用最佳。

圖1 毛建茶對大鼠血清中 ALT、AST的影響Fig.1 Effects of Maojian tea on ALT, AST in serum of rats

過量酒精導致肝細胞膜磷脂發生過氧化反應，產生大量脂自由基，導致脂肪酸的β氧化障礙，肝細胞中TG的代謝紊亂，出現脂肪堆積[21]，因此血清中TC、TG水平高低可以反映肝細胞脂肪堆積的異常程度。如圖2所示，與CON組相比，ALI-M組大鼠血清中的TC、TG水平顯著升高（P<0.05）；與ALIM組相比，DBGT組TC及TG水平均顯著降低（P<0.05），MJ-H組大鼠血清中的TC水平極顯著降低（P<0.01），MJ-L組大鼠血清中的TG水平極顯著降低（P<0.01）。MJ-H組和MJ-M組大鼠血清中的TG水平以及MJ-L組大鼠血清中的TC水平有下降趨勢，但無顯著差異（P>0.05）。毛建茶高劑量組和低劑量組能夠改善慢性酒精性肝損傷大鼠的脂肪異常堆積，以低劑量組降低TG作用最佳。

圖2 毛建茶對大鼠血清中 TC、TG的影響Fig.2 Effects of Maojian tea on TC, TG in serum of rats

2.3 毛建茶對慢性酒精性肝損傷大鼠肝臟中MDA、SOD、GSH的影響

酒精誘導肝細胞產生氧化損傷的過程中，會有大量活性氧自由基產生，引起肝細胞膜的脂質過氧化，從而導致過氧化反應終產物MDA含量增加，并且加快可清除自由基的抗氧化物質GSH和SOD的消耗，因此肝組織中MDA、GSH含量及 SOD 活性的高低可以反映肝細胞氧化損傷程度的大小[19,22]。如圖3所示，與CON組相比，ALI-M組中大鼠MDA指標水平較為極顯著升高（P<0.01），GSH和SOD水平極顯著降低（P<0.01）；與ALI-M組相比，DBGT組和MJ-H組MDA指標水平極顯著降低（P<0.01），DBGT組和毛建茶各劑量組GSH和SOD的含量極顯著上升（P<0.01）；毛建茶各劑量組能夠明顯改善酒精對肝細胞的氧化損傷，以高劑量組效果最佳。

圖3 毛建茶對大鼠肝臟中 MDA、SOD、GSH的影響Fig.3 Effects of Maojian tea on MDA, SOD, GSH in liver of rats

2.4 毛建茶對慢性酒精性肝損傷大鼠肝臟病理組織變化的影響

如圖4所示，CON組肝細胞排列整齊，無明顯脂肪空泡和炎性細胞浸潤；ALD-M組肝組織可見肝細胞脂肪變性，胞質中含有較多小的脂肪空泡；局部靜脈周圍可見明顯炎性細胞浸潤；經治療后DBGT組肝組織中無明顯脂肪空泡，偶有少量炎性細胞浸潤；MJ-H組和MJ-M組仍可見少量小的脂肪空泡，MJ-L組無明顯脂肪空泡，毛建茶各劑量組肝組織中炎性細胞浸潤明顯減輕。

圖4 毛建茶對大鼠肝臟病理組織變化的影響（H&E×400）Fig.4 Effect of Maojian tea on liver pathological changes after hematoxylin-eosin（H&E）staining

3 討論與結論

ALD 是臨床常見的導致肝功能障礙以及肝相關疾病致死的常見原因，其發病機制復雜，乙醇及其代謝產物對肝臟的損傷、氧化應激為其主要發病機制[23?24]。酒精進入人體后主要在肝臟中代謝并產生大量乙醛，乙醛會上調固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）促進脂肪酸的合成，同時乙醛抑制DNA結合能力和過氧化物酶體增殖物激活受體α的轉錄活性來抑制脂肪酸氧化，最終導致TG在肝細胞內積累[25]。酒精攝入人體后主要通過乙醇脫氫酶（ADH）及微粒體乙醇氧化系統（MEOS）代謝乙醇，誘導細胞色素P450 2E1 （CYP2E1）表達，產生大量活性氧（ROS）[26]，代謝產生的乙醛、ROS激活庫普弗細胞即肝巨噬細胞促使炎癥反應，ROS誘發脂質過氧化反應并促使脂質過氧化標志物—MDA含量增加[27]，而抗氧化物質SOD及GSH含量下降。酒精性肝毒性和酒精代謝引起的氧化應激和炎癥反應，會導致線粒體依賴性細胞凋亡，加速ALD的進展[28]。

根據中華醫學會肝臟病學分會提出的ALD診療指南，其臨床可分為輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化4個類型[29]。本文根據文獻[17]采用連續6周灌服50%的方法造成慢性酒精性肝損傷模型，引起ALT和AST的輕度升高（以AST升高為主）、血清中TC和TG的輕度升高、肝細胞中有脂肪空泡出現和輕度的肝臟炎癥，接近ALD早期階段病變-輕癥酒精性肝病，與國外實驗室常用的慢性酒精喂養模型（Lieber-DeCarli模型）的造模效果相當[30]。通常ALT和AST作為肝損傷的敏感指標，當機體攝入過量酒精引起的肝損害使肝細胞膜通透性增加時，會導致肝細胞漿中的ALT大量釋放進入血液，使血清中ALT升高；而當酒精引起的肝損傷損害肝細胞中的線粒體時，會導致大量AST釋放到血液中，血清中會以AST升高為主[31]。本次實驗中慢性酒精性肝損傷模型組雖然ALT和AST都明顯升高，但以AST升高為主，推測在本實驗條件下肝細胞損傷以線粒體損傷為主，肝細胞膜通透性的影響不顯著，毛建茶高低劑量都未表現出顯著降低ALT作用可能與此原因有關，以低劑量組降低AST作用最佳。

慢性酒精性肝損傷引起的脂質堆積以TG升高為主，本次慢性酒精性肝損傷模型也表現為以TG升高為主，TC僅輕度升高。由于病理切片中肝脂肪變性所形成的細胞內空泡其主要成分是TG，光鏡下觀察毛建茶低劑量組改善脂肪變性的作用最為明顯，與生化指標變化一致。毛建茶高劑量組能夠顯著降低TC，低劑量組能夠顯著降低TG 水平，具有一定的降血脂作用，但毛建茶調節血脂的劑量關系有待進一步優化，今后應結合高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）等載脂蛋白指標以及甘油三酯和膽固醇各自的代謝通路進一步探討毛建茶降脂作用量效關系和作用機制。

本次研究對毛建茶的解酒和保肝作用進行了研究，并從抗氧化損傷角度初步探討了其作用機制。結果表明毛建茶高劑量組解酒效果最佳，對慢性酒精性肝損傷大鼠的肝細胞保護和降低TG作用以低劑量組效果最佳，毛建茶各劑量組都具有一定的抗氧化應激作用，其中以高劑量組作用最佳。綜上所述，毛建茶具有一定的解酒保肝作用，為其日常應用和市場推廣提供了實驗依據。