三葉木通果皮主要營(yíng)養(yǎng)成分、活性成分含量測(cè)定及果皮提取物抗氧化活性評(píng)價(jià)

張孟琴 ，徐 路，張俊波，歐根友，向 嬡

（1.銅仁學(xué)院，材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州銅仁 554300；2.銅仁學(xué)院，貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州銅仁 554300；3.銅仁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴州銅仁 554300）

三葉木通（Akebia trifoliata）也稱“八月瓜”、“野香蕉”等，果實(shí)在中秋節(jié)前后成熟，且形似香蕉，屬多年生落葉木質(zhì)藤本植物[1?2]，是典型的“食藥油賞”同源植物。果實(shí)甘甜味糯，富含人體生長(zhǎng)發(fā)育所需的多種營(yíng)養(yǎng)及活性成分[3?4]，有“天然保健圣果”之美譽(yù)，在我國(guó)河南、陜西、貴州、甘肅及長(zhǎng)江流域等多省份均有分布[5]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，三葉木通根、藤及果皮均富含齊墩果酸、常春藤皂苷、黃酮、多酚、萜類等活性成分[6?10]，具有抗氧化、降血糖、通經(jīng)活血、保肝防癌、抑菌美白等多種功效[10?13]。羅宗洪等[10]研究了云南野生三葉木通，發(fā)現(xiàn)其果皮和種籽的提取物能較好地抑制α-葡萄糖酶活性。張可蘭等[12]的研究表明，三葉木通藤莖總黃酮對(duì)小鼠的急性肝損傷組織有明顯的改善和保護(hù)作用；Lu等[13?14]均發(fā)現(xiàn)三葉木通種子提取物能顯著抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移及增值；鐘彩虹等[15]的研究顯示，三葉木通果實(shí)提取物對(duì)賴氨酸酶的抑制作用與熊果苷相當(dāng)，可有效抑制黑素細(xì)胞的增殖；魏晶[16]從三葉木通藤莖提取的多糖能清除多種自由基，而且對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有顯著的抑制作用。仲偉敏等[17]和白成科[18]對(duì)三葉木通種子中的脂肪酸及氨基酸和礦質(zhì)元素進(jìn)行了測(cè)定，其結(jié)果顯示，在所測(cè)的脂肪酸中不飽和脂肪酸含量占74.51%，測(cè)定的氨基酸中人體必需氨基酸占55.19%，且礦質(zhì)元素（K、Mg、Fe、Cu）含量均高于花生和玉米等作物。此外，以三葉木通種籽為原料制備生物柴油的研究也取得了初步成效[19]。

近年來，野生三葉木通的人工栽培技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)突破并趨于成熟[20]，在我國(guó)陜西、四川、貴州、湖北、河南等省份己開始較大規(guī)模的種植和產(chǎn)業(yè)化初步開發(fā)。目前，以三葉木通為原料開發(fā)的果茶、果酒、飲料、食用油脂等產(chǎn)品正逐步進(jìn)入市場(chǎng)，因其綠色、健康、保健等良好功效，開始受到越來越多人的青睞。種植業(yè)的快速發(fā)展必然帶動(dòng)三葉木通深加工產(chǎn)業(yè)的不斷優(yōu)化，其開發(fā)潛力不可估量。相比栽培技術(shù)的不斷創(chuàng)新和種植面積的不斷擴(kuò)大，三葉木通的深加工水平才剛剛起步，產(chǎn)品遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需要，尤其果實(shí)的可食率極低，非可食果皮占果實(shí)總重量的60%～70%。本研究測(cè)定了三葉木通果皮中蛋白質(zhì)、脂肪、礦質(zhì)元素、粗纖維、VC等主要營(yíng)養(yǎng)成分及總黃酮、總酚、總皂苷等功能活性成分的含量，并研究了果皮提取物的抗氧化活性，這些研究可為三葉木通資源的綜合利用提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)，對(duì)提高三葉木通的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、助力山區(qū)農(nóng)民脫貧攻堅(jiān)具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生三葉木通果實(shí) 采自貴州銅仁謝橋鎮(zhèn)，經(jīng)同行專家鑒定為三葉木通Akebia trifoliate的果實(shí)；蘆丁、沒食子酸、齊墩果酸、ABTS（2,2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽）、DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）均為標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司；各單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度均為1000 μg/mL） TMRM壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；其他試劑 均為分析純。

UV1800紫外可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；ETHOS-1型微波消解儀 意大利Miletstone公司；Prodigy ICP原子發(fā)射光譜儀 美國(guó)Leeman公司；Kjeltec 8200 全自動(dòng)凱氏定氮儀 德國(guó)Fuchs公司；KSL-1400X箱式馬弗爐 合肥科晶材料技術(shù)有限公司；FA2004電子分析天平 上海力辰科技有限公司；DHG-9030A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒有限公司；YTLG-12B真空冷凍干燥箱 上海葉拓有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基本營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定 灰分、脂肪、蛋白質(zhì)、VC、水分等含量的測(cè)定分別參照GB/T 5009-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》[21]中“食品中總灰分的測(cè)定方法”、“酸水解法測(cè)定脂肪”、“凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)”、VC含量測(cè)定中的第一法、水分含量測(cè)定中的第一法；粗纖維含量的測(cè)定采用GB/T 8310-2013[22]中的方法；還原糖及總糖含量的測(cè)定分別采用3,5-二硝基水楊酸標(biāo)準(zhǔn)曲線法和苯酚-硫酸標(biāo)準(zhǔn)曲線法[23]；果膠含量的測(cè)定采用水提醇沉法[24]；礦物元素含量的測(cè)定采用高壓微波消解果皮，用電感耦合等離子原子發(fā)射光譜法（Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry，AES-ICP）[25]。

本研究采用文良娟等[26]研究的西番蓮果皮中的部分營(yíng)養(yǎng)成分與所測(cè)的三葉木通果皮營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行對(duì)照，并計(jì)算其差異百分率，比較兩種不同類型果皮中各營(yíng)養(yǎng)成分含量的差異。差異百分率按公式（1）計(jì)算：

1.2.2 功能活性成分的提取與含量測(cè)定

1.2.2.1 果皮提取物的制備 三葉木通果皮置于干燥箱內(nèi)50 ℃下烘干，粉碎過40目篩。按兩種料液比（1:15和1:10 g/mL）依次用75%乙醇溶液于80 ℃下各回流提取2次，2 h/次，濾液合并，減壓濃縮，浸膏于冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，稱重。取適量?jī)龈善罚?0%乙醇微熱溶解，配制成0.1 mg/mL凍干樣液待用。

1.2.2.2 總黃酮含量的測(cè)定 以蘆丁為標(biāo)品，采用亞硝酸鈉-三氯化鋁法[27]，510 nm處測(cè)定吸光值，制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1 mL凍干樣液，同法顯色，由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（y=0.009x+0.0026，R2=0.9993）計(jì)算樣液中總黃酮含量。果皮樣品中總黃酮的含量按公式（2）計(jì)算：

式中，n：稀釋倍數(shù)；wa：果皮提取物凍干后的質(zhì)量，g；wb：三葉木通果皮干重，g；c：凍干液中活性成分（總黃酮、總酚、總皂苷）的濃度，mg/mL；0.1為0.1 mg/mL凍干樣液。

1.2.2.3 總酚含量的測(cè)定 以沒食子酸為標(biāo)品，采用Folin-Ciocalten 法[27]，765 nm處測(cè)定吸光值，制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1 mL凍干樣液，同法顯色，由沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（y=0.1656x+0.0155，R2=0.9994）計(jì)算樣液中總酚含量。果皮樣品中總酚的含量按公式（2）計(jì)算。

1.2.2.4 總皂苷含量的測(cè)定 以齊墩果酸為標(biāo)品，采用香草醛-高氯酸法[28]，550 nm處測(cè)定吸光度，制作齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1 mL凍干樣液，同法顯色，由齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（y=9.8854x?0.0306，R2=0.9996）計(jì)算樣液中總皂苷含量。果皮樣品中總皂苷的含量按公式（2）計(jì)算。

1.2.3 抗氧化活性測(cè)定

1.2.3.1 不同質(zhì)量濃度果皮提取液的配制 80%乙醇對(duì)凍干樣液（0.1 mg/mL）進(jìn)行逐級(jí)稀釋，配制不同質(zhì)量濃度的果皮溶液（以下簡(jiǎn)稱樣液）。

1.2.3.2 三葉木通果皮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力 取 0.5 mL 樣液，加入2.5 mL DPPH乙醇溶液（0.1 mmol/L），黑暗處緩慢搖動(dòng)30 min，517 nm處測(cè)定吸光度[29?30]，VC作對(duì)照。DPPH自由基的清除率計(jì)算公式如下：

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式中，A2：0.5 mL樣液與2.5 mL DPPH乙醇液混合后的吸光度；A1：0.5 mL樣液與2.5 mL乙醇混合后的吸光度；A0：2.5 mL DPPH溶液與0.5 mL乙醇混合后的吸光度（A0）。

1.2.3.3 三葉木通果皮提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力 ABTS工作液的配制[29?30]：取5 mL ABTS溶液（7 mmol /L）與88 μL K2S2O8溶液（40 mmol /L）混均，室溫避光放置14 h，80%乙醇稀釋之使其在734 nm處的吸光度達(dá)到0.7左右，成為ABTS工作液。

測(cè)定方法[29?30]：取0.3 mL的樣液和2.7 mL的ABTS工作液充分混勻，室溫下避光反應(yīng)10 min，在734 nm處測(cè)定吸光值，VC做陽性對(duì)照。清除率按如下公式計(jì)算：

式中，A2：0.3 mL樣液和2.7 mL ABTS工作液混合后的吸光度；A1：0.3 mL樣液與2.7 mL 80%乙醇混合后的吸光值；A0：2.7 mL ABTS工作液與0.3 mL 80%乙醇混合后的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Origin 8.0進(jìn)行處理并繪制圖表，相關(guān)性分析使用SPSS 19.0 軟件，各營(yíng)養(yǎng)成分及活性成分的含量均平行3次實(shí)驗(yàn)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本營(yíng)養(yǎng)成分含量

因西番蓮果是目前流行的一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值較高的水果，已普遍被大眾所認(rèn)可和喜愛，目前已被廣泛開發(fā)和利用[31]。但三葉木通果皮還處于剛剛開發(fā)階段，其附加值較低，本研究與西番蓮果皮中的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行對(duì)照，旨在為三葉木通產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。本研究通過計(jì)算西番蓮果皮和三葉木通果皮中部分營(yíng)養(yǎng)成分含量的差異百分比，可以直觀對(duì)比二者營(yíng)養(yǎng)成分含量的差異。由表1可知，三葉木通果皮中除粗纖維含量（16.00%±0.03%）低于西番蓮果皮（21.1%），二者之間的差異百分比為?24.17%外，其余所檢測(cè)的營(yíng)養(yǎng)成分含量均高于西番蓮果皮。三葉木通果皮中脂肪含量（2.45%±0.21%）遠(yuǎn)高于西番蓮果皮（0.56%），其差異百分比達(dá)+337.50%；蛋白質(zhì)含量幾乎是西番蓮果皮的2倍，其差異百分比達(dá)到+68.60%；三葉木通果皮中果膠含量（20.08%±0.20%）也高于西番蓮果皮（12.50%），二者差異百分比達(dá)到+60.64%。兩種不同種類的果皮中，還原糖的含量接近，差異百分比為+9.72%，但三葉木通果皮中總糖含量（32.61%±0.18%）高于西番蓮果皮中總糖的含量（22.60%），二者的差異百分率為+44.30%。三葉木通果皮中水分的含量為 8.65%±0.02%，VC的含量極低，未被檢出。兩種果皮的部分營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比結(jié)果表明，三葉木通果皮中的營(yíng)養(yǎng)成分含量高于西番蓮果皮，在果茶、果醬、果膠等產(chǎn)品的開發(fā)中優(yōu)勢(shì)更加明顯。該結(jié)果可為三葉木通果皮的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

表1 三葉木通果皮中主要營(yíng)養(yǎng)成分含量（%）Table 1 Contents of nutritional components in Akebia trifoliate pericarp (%)

2.2 礦物元素含量

本研究對(duì)三葉木通果皮中的營(yíng)養(yǎng)元素K、Ca、Mg、Fe、Na、Mn、Cu、Zn等含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示（見圖1），三葉木通果皮中不僅含有豐富的人體必需常量元素 K、Ca、Mg 和 Na，而且含有人體代謝必需的微量元素 Fe、Cu、Zn和Mn 。所測(cè)得的8種礦質(zhì)元素含量順序依次為K>Ca>Mg>Fe>Mn>Na>Cu>Zn。其中，K元素含量最高（14061.17±105.21 μg/g DW），其次是Ca （4959.28±55.00 μg/g DW）、Mg （1727.57±25.34 μg/g DW）和Na（58.36±1.57 μg/g DW）。微量元素Fe、Cu、Mn和Zn含量分別為95.58±1.05、7.9124±0.05、69.58±0.24和 6.0914±0.02 μg/g DW。礦質(zhì)元素是人體新陳代謝及生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分，缺失會(huì)導(dǎo)致身體發(fā)育遲緩和疾病的發(fā)生[32]。所測(cè)的8種礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量雖不及王瑩等[33]研究的百香果皮中各營(yíng)養(yǎng)元素的含量高，但均比陳媚等[34]研究的大果西番蓮果皮和張莉等[35]研究的蘋果皮中高的多，與劉紅昌等[36]通過原子吸收光度法測(cè)定的貴州其他地區(qū)三葉木通果皮相比，除Na、Cu、Zn 元素含量差異較大外，其余5種元素含量相差均較小。說明果皮中部分礦物元素的含量雖然受生態(tài)環(huán)境的影響，但大多數(shù)營(yíng)養(yǎng)元素含量由遺傳因素所決定。因此，三葉木通果皮可作為特色新品種的研發(fā)對(duì)象和功能產(chǎn)品材料進(jìn)行加工利用。

圖1 三葉木通果皮中8種礦物元素的含量Fig.1 Contents of eight mineral elements in the pericarp ofAkebia trifoliata

2.3 各功能活性成分含量

表2 三葉木通果皮中活性成分含量 （mg/g DW）Table 2 Content of active ingredients in Akebia trifoliatepericarp (mg/g DW)

2.4 三葉木通果皮抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.4.1 三葉木通果皮提取物對(duì)DPPH和ABTS+自由基的清除能力 本研究以VC為陽性對(duì)照（圖2A），考察果皮提取物在不同濃度梯度下對(duì)DPPH和ABTS+自由基的清除能力。圖2B可知，三葉木通果皮提取物對(duì)DPPH·有一定的清除能力，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)（0.01～0.085 mg/mL）呈良好的量效關(guān)系，在濃度為0.085 mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到84.81%；通過對(duì)提取物濃度的對(duì)數(shù)與清除率概率單位進(jìn)行線性擬合，得到的擬合方程y=2.7269x+8.5712，R2=0.9835，IC50的值計(jì)算后為0.049 mg/mL，該結(jié)果與羅宗洪等[10]對(duì)云南三葉木通果皮（IC50=53.56 μg/mL）的測(cè)試結(jié)果相近，說明相同的物種在生長(zhǎng)發(fā)育過程中其活性物質(zhì)的功能作用主要由遺傳因素決定。

圖2 三葉木通果皮提取物對(duì)DPPH·的清除能力Fig.2 Scavenging capabilities to DPPH· from different concentrations of extracts from Akebia trifoliate pericarp

圖3B可知，三葉木通果皮提取物對(duì)ABTS+自由基也具有一定清除能力，且隨著提取物濃度的升高，清除能力逐漸增強(qiáng)，表明提取物濃度與清除ABTS+自由基能力呈正向量效關(guān)系。利用Origin對(duì)提取物濃度對(duì)數(shù)與清除率概率單位進(jìn)行線性擬合，其擬合方程為y=2.8403x+8.6663，R2=0.9828，IC50為0.052 mg/mL，該結(jié)果比羅宗洪等[10]用同法測(cè)定的云南三葉木通果皮（IC50=42.25 μg/mL）略高。但清除能力不及VC（在實(shí)驗(yàn)最低濃度時(shí)半數(shù)清除率已高于50%）（圖3A）。

圖3 三葉木通果皮提取物對(duì)ABTS+·的清除能力Fig.3 Scavenging capabilities to ABTS+· from different concentrations of extracts from Akebia trifoliate pericarp

細(xì)胞內(nèi)積累大量的活性氧自由基，可造成細(xì)胞壞死與組織損傷，破壞核酸的結(jié)構(gòu)，引起DNA突變等，是人體衰老和患病的根源[39?40]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三葉木通果皮提取物對(duì)DPPH、ABTS+等自由基均有一定的清除能力，該研究結(jié)果可為貴州三葉木通果皮的深度開發(fā)提供一定的參考。

2.4.2 抗氧化活性成分與抗氧化能力相關(guān)性 對(duì)不同質(zhì)量濃度提取物中各活性成分的含量及自由基清除率進(jìn)行測(cè)定，利用 Spearman函數(shù)對(duì)各活性成分與抗氧化能力間的相關(guān)性進(jìn)行分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各活性成分含量與清除DPPH、ABTS+自由基能力之間存在極顯著相關(guān)性（P<0.01）（表3），此外，三種活性成分之間的相關(guān)性也達(dá)到極顯著水平。

表3 三葉木通果皮提取物活性成分與抗氧化能力相關(guān)性Table 3 Correlations between antioxidant contents and capabilities from pericarp extracts of Akebia trifoliate

3 結(jié)論

本研究以貴州銅仁謝橋鎮(zhèn)野生三葉木通果皮為原料，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分及活性功能成分進(jìn)行測(cè)定分析，并評(píng)價(jià)了果皮提取物對(duì)DPPH和ABTS+自由基的抗氧化活性。研究結(jié)果表明，三葉木通果皮中含有較豐富的蛋白質(zhì)、脂肪及礦質(zhì)元素。其活性成分總黃酮、總酚及總皂苷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于多數(shù)藥食同源植物，其中，總酚含量為（31.53±0.18）mg/g DW，總黃酮和總皂苷含量分別達(dá)到（20.58±0.12）mg/g DW和（45.20±12.04）mg/g DW。抗氧化實(shí)驗(yàn)顯示，果皮提取物對(duì)DPPH和ABTS+自由基有較強(qiáng)的清除能力，并和濃度有顯著的量效關(guān)系。Spearman相關(guān)性分析表明，總皂苷、總酚和總黃酮等含量與抗氧化能力呈正相關(guān)。本研究結(jié)果不僅可為貴州銅仁地區(qū)的野生三葉木通資源的開發(fā)利用提供一定的理論支持，而且為三葉木通產(chǎn)業(yè)鏈的延伸及產(chǎn)品的深度開發(fā)提供了一定的參考。