基于高效液相色譜指紋圖譜和多成分含量的淫羊藿傳統飲片、破壁粉與破壁飲片比較*

李友露，徐 劍，2，3△，繆艷燕，2，3，曹國瓊，2，3，田洪星，張永萍，2，3

（1. 貴州中醫藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州中藥炮制與制劑工程技術研究中心，貴州 貴陽550025； 3. 國家苗藥工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025）

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicomuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb. etZucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim. 或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai 的干燥葉，主產于貴州、湖北、四川、遼寧、陜西、湘西等地［1-2］，主要活性成分為黃酮類成分。現代藥理學研究表明，淫羊藿黃酮類成分具有抗氧化［3］、抗腫瘤［4］、抗炎［5］和抗骨質疏松［6］等作用，臨床應用廣泛［7］。超微粉碎技術因其破壁后與原傳統飲片的物質基礎一致，可加快有效成分溶出，提高生物利用度，且具有攜帶方便、用藥靈活等優勢，能解決市場需求量大、資源緊缺的問題［8-10］。淫羊藿破壁飲片是利用超微粉碎技術將傳統飲片粉碎到粉體粒徑（D90）小于45 μm 的破細胞壁粉體，再采用成型技術加工成40～80目的干燥顆粒狀飲片。文獻［1，11-12］表明，淫羊藿黃酮類成分易受生長環境、產地加工、炮制、儲存等因素影響，可導致有效成分提取不均勻、穩定差等問題。但破壁技術也面臨一系列問題，如經粉碎工藝后失去了原飲片的外觀性狀、顯微結構特征，比表面積顯著增大，以及破壁過程中的高速摩擦、滾動產生的熱量對黃酮類成分產生影響，進而影響臨床療效［13-14］。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法建立了12 批淫羊藿傳統飲片、破壁粉、破壁飲片的指紋圖譜，并對其進行相似度評價，同時建立了5 個指標性成分的含量測定方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XT-A400 型多功能粉碎機（永康市紅太陽機電有限公司）；HBM-109型超微粉碎機（瑞安市瀚博機電有限公司）；GZX - 9240MBE 型電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司）；ATY224 型電子分析天平（日本島津公司，精度為100 mg）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；1260 型Agilent 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Milli-Q型超純水儀（德國默克密理博公司）。

1.2 試藥

朝藿定A 對照品（批號為MUST-14060312），朝藿定B 對照品（批號為MUST - 14062312），純度均大于98%，購于成都曼思特生物科技有限公司；朝藿定C 對照品（批號為110756-200110），淫羊藿苷對照品（批號為110737-201516），寶藿苷Ⅰ對照品（批號為111852-201603），純度均大于98%，購于中國食品藥品檢定研究院；水為自制超純水；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；淫羊藿飲片購自貴州同濟堂藥材有限公司，經貴州中醫藥大學何順志教授鑒定為淫羊藿Epimedium brevicomuMaxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim. 和朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai。詳見表1。

表1 12批淫羊藿飲片信息Tab.1 Information of 12 batches of Epimedii Folium decoction pieces

2 方法與結果

2.1 色譜條件［15］

色譜柱：Odyssil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：水（A）- 乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min 時75%A～74%A，10～38 min 時74%A，38～43 min 時74%A～59%A，43～49 min時59%A～58%A，49～55 min時58%A，55～64 min 時58%A～35%A，64～85 min 時35%A～15%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：270 nm；進樣量：10 μL。

2.2 樣品及溶液制備

2.2.1 樣品制備

傳統飲片：稱取淫羊藿飲片適量，置多功能粉碎機中粉碎40 s，粉末過80目篩，密封，備用（編號為A1-A12）。

破壁粉：取上述細粉適量，使用超微粉碎機調整粗細旋轉軸長度為0.6 cm，粉碎1 次，密封，備用（編號為B1-B12）。

破壁飲片：取上述破壁粉適量，混勻，加入15%乙醇，按料液比0.62∶1（m/V）制成軟材，35目篩網制得濕顆粒，60 ℃干燥70 min，過篩整粒，密封，備用（編號為C1-C12）。

2.2.2 溶液制備

供試品溶液：取淫羊藿傳統飲片、破壁粉、破壁飲片各0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（頻率為40 kHz，功率為500 W）45 min，冷卻至室溫，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，離心（轉速為14000 r/min）10 min，取上清液，即得。

對照品溶液：取淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷Ⅰ對照品各適量，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 分別含1.84，1.69，1.81，1.50，1.99 mg的溶液，搖勻，即得。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 參照峰確定

本研究中所建立指紋圖譜中淫羊藿苷的色譜峰分離良好，峰面積較大，保留時間適中，且為所有樣品共有，參照2020年版《中國藥典（一部）》淫羊藿項下淫羊藿苷的含量測定方法［15］，以淫羊藿苷為參照峰。

2.3.2 方法學考察

精密度試驗：取2.2.1 項下淫羊藿傳統飲片（編號為A1）、破壁粉（編號為B1）和破壁飲片（編號為C1）各適量，精密稱定，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖。結果共有峰相對保留時間的RSD分別為0.02%～0.14%、0.05%～0.09%、0.09%～0.18%（n=6），相對峰面積的RSD分別為1.44%～2.88%、2.46%～2.92%、1.57%～2.64%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取精密度試驗項下供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別進樣測定6次，記錄色譜圖。結果共有峰相對保留時間的RSD為0.07%～0.15%、0.03%～0.16%、0.01%～0.24%（n=6），相對峰面積的RSD為 1.97%～2.70%、1.05%～2.82%、1.90%～2.86%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取精密度試驗項下供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別于0，3，6，9，12，18，24 h 時進樣測定，記錄色譜圖。結果共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～1.27%、0.05%～1.35%、0.05%～1.29%（n=7），相對峰面積的RSD為1.74%～2.55%、1.44%～2.99%、1.20%～2.89%（n=7），表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.3 指紋圖譜建立及共有峰指認

取12 批淫羊藿傳統飲片、破壁粉、破壁飲片，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將所得圖譜錄入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）軟件，以中位數法分析，設置參照圖譜。其中，傳統飲片為編號A1-A12、破壁粉為編號B1- B12、破壁飲片為編號C1- C12，各自生成12批淫羊藿傳統飲片、破壁粉、破壁飲片指紋圖譜與對照指紋圖譜疊加圖（圖1）。共標定13 個共有峰，結合對照品指認了其中的5 個共有峰，其中3 號峰為朝藿定A，4 號峰為朝藿定B，5 號峰為朝藿定C，7 號峰為淫羊藿苷，11號峰為寶藿苷Ⅰ。

2.3.4 相似度評價

12 批淫羊藿傳統飲片、破壁粉、破壁飲片各自生成的共有模式圖譜即為對照圖譜（R），評價12批樣品與各自對照圖譜（R）之間的相似度，結果見表2 至表4。淫羊藿傳統飲片為0.419～1.000，破壁粉為0.435～1.000，破壁飲片為0.425～1.000。12 批傳統飲片A1- A4和A11，破壁粉B1-B3和B11，以及破壁飲片C1-C3和C11之間的相似度較高（＞0.90）；破壁粉（編號為B1-B3，B7，B10-B11）、壁破飲片（編號為C1-C3，C7，C10-C11）間的相似度較高，表現出近似的變化規律，表明淫羊藿種屬的不同、產地或時間的不同導致其成分含量有所不同［1，3，16-17］，質量穩定性有待提升。

表2 12批淫羊藿傳統飲片指紋圖譜相似度評價結果Tab.2 Evaluation results of fingerprint similarity of 12 batches of Epimedii Folium traditional decoction pieces

表3 12批淫羊藿破壁粉指紋圖譜相似度評價結果Tab.3 Evaluation results of fingerprint similarity of 12 batches of Epimedii Folium cell-wall broken powder

表4 12批淫羊藿破壁飲片指紋圖譜相似度評價結果Tab.4 Evaluation results of fingerprint similarity of 12 batches of Epimedii Folium cell-wall broken decoction pieces

2.3.5 指紋圖譜相關性分析

將上述12 批淫羊藿傳統飲片共有模式（S1）、破壁粉體共有模式（S2）、破壁飲片生成的圖譜共有模式（S3）分別導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版），生成對照圖譜（R），進行相似度比較，結果見圖2 和表5。結果表明，淫羊藿傳統飲片、破壁粉及破壁飲片與對照圖譜（R）之間的相似度較高（＞0.99），表明淫羊藿傳統飲片經破壁加工制成破壁粉、無添加成型工藝制備破壁飲片的過程中，有效成分的整體概貌沒有發生明顯變化，工藝流程質量穩定。

表5 12批淫羊藿傳統飲片、破壁粉及破壁飲片相似度評價結果Tab.5 Similarity evaluation results of 12 batches of Epimedii Folium traditional decoction pieces，cell-wall broken powder and cell-wall broken decoction pieces

2.4 多指標成分含量測定

2.4.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜條件同2.1 項下。取2.3.2 精密度試驗項下供試品溶液（樣品編號為A1）和2.2.2項下對照品溶液，按2.1 項下色譜條件分別進樣10 μL 測定。色譜圖見圖3。結果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ之間的分離度良好，相鄰色譜峰間分離度均大于1.5，對樣品的測定無干擾。

2.4.2 方法學考察

線性關系考察：精密吸取2.2.2 項下對照品溶液，加乙醇稀釋成系列對照品溶液，朝藿定A質量濃度分別為1.84，0.92，0.59，0.30，0.15，0.07，0.04 mg/mL，朝藿定B 質量濃度分別為1.69，0.85，0.42，0.21，0.11，0.05，0.03 mg/ mL，朝藿定C 質量濃度分別為1.81，0.90，0.45，0.23，0.11，0.06，0.03 mg/ mL，淫羊藿苷質量濃度分別為1.50，0.75，0.38，0.18，0.09，0.05，0.02 mg/mL，寶藿苷Ⅰ分別為1.99，1.00，0.50，0.25，0.12，0.06，0.03 mg/ mL。按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰峰面積，以質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表6。

表6 線性關系考察結果（n=7）Tab.6 Results of the linear relation test（n=7）

精密度試驗：精密吸取2.2.2 項下對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，測得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ峰面積的RSD分別為0.24%，0.14%，0.12%，0.15%，0.48%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取淫羊藿傳統飲片（編號為A1）0.2 g，按2.2.2 項下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定6 次，測得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ峰面積的RSD分別為0.98%，0.84%，0.52%，0.65%，1.14%（n= 6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取淫羊藿傳統飲片（編號為A1）0.1 g，精密稱定，共9 份，按80%，100%，120%的比例加入朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ對照品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果平均加樣回收率分別為101.01%，103.84%，99.25%，103.40%，102.65%，RSD分別為1.37%，0.95%，0.74%，0.81%，0.31%（n=9）。

2.5 多指標成分含量比較

通過對比淫羊藿傳統飲片、破壁粉、破壁飲片的HPLC指紋圖譜，發現其化學成分組成差異較小，但色譜峰峰面積存在一定差異。淫羊藿主要含有黃酮類成分，且朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ已納入藥典標準，上述成分是淫羊藿發揮藥效的重要活性物質。本研究中采用HPLC法測定上述三者中多指標成分含量。

采用SPSS 26.0統計學軟件對5個指標性成分進行多個獨立樣本非參數檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。指標性成分總含量從高到低依次為破壁粉＞破壁飲片＞傳統飲片分別為6.43%，5.76%，5.43%。由表7可知，淫羊藿破壁粉及破壁飲片各指標性成分平均含量均高于傳統飲片，但均無顯著差異（P＞0.05）。

表7 12批淫羊藿傳統飲片、破壁粉和破壁飲片多指標成分含量測定及非參數檢驗結果（±s，%）Tab.7 Content determination of multi-index components and nonparametric test results of 12 batches of Epimedii Folium traditional decoction pieces，cell-wall broken powder and cell-wall broken decoction pieces（±s，%）

表7 12批淫羊藿傳統飲片、破壁粉和破壁飲片多指標成分含量測定及非參數檢驗結果（±s，%）Tab.7 Content determination of multi-index components and nonparametric test results of 12 batches of Epimedii Folium traditional decoction pieces，cell-wall broken powder and cell-wall broken decoction pieces（±s，%）

樣品傳統飲片破壁粉破壁飲片χ2值P值朝藿定A 0.62±0.150.65±0.150.67±0.100.4970.780朝藿定B 1.27±0.561.33±0.301.29±0.551.2720.529朝藿定C 1.94±2.242.55±2.552.06±1.670.2210.895淫羊藿苷1.46±0.251.75±0.471.57±0.303.4600.177寶藿苷Ⅰ0.14±0.050.15±0.050.17±0.042.5860.274

3 討論

3.1 色譜條件優化

參照2020年版《中國藥典（一部）》淫羊藿含量測定色譜條件，并進行優化，采用紫外-可見分光光度計對淫羊藿樣品進行全波長掃描，270 nm 波長處檢測信號較強，色譜峰數目較多，且分離度良好；曾比較色譜柱Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和OdyssiL C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），OdyssiL C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）的色譜峰分離效果較佳，峰形較好；曾比較乙腈- 水、乙腈-0.1%醋酸、乙腈-0.1%磷酸流動相系統，選擇乙腈-水作為流動相，色譜峰數目較多、峰形和分離度均較好，曾比較柱溫25，30，35 ℃，發現柱溫過高出峰時間較快、分離效果較差，柱溫太低出峰時間延長，故柱溫選擇30 ℃。最終確定2.1項下色譜條件。

3.2 樣品提取條件優化

不同提取條件會影響有效成分的提取［18］。本研究中以共有峰峰面積/質量為評價指標，分別考察了提取方法（超聲、回流、浸漬），提取溶劑（甲醇、無水乙醇、50%乙醇、80%乙醇），提取溶劑劑量（20，30，40 mL），提取時間（15，45，75 min）。結果發現，超聲提取方便快捷，有利于節省時間，也能很好地把較多成分提取出來；提取溶劑為50%乙醇時色譜峰峰形和分離度均較好；提取45 min 可提取完全；提高溶劑劑量，共有峰峰面積/質量增加幅度不大。同時，考慮溶劑成本，最終選擇提取溶劑劑量為20 mL。

3.3 不同批次淫羊藿傳統飲片、破壁粉及破壁飲片化學組分傳遞分析

所建立淫羊藿傳統飲片、破壁粉及破壁飲片的HPLC指紋圖譜共標定13個共有峰，整體形貌上無化學組分數量、種類的變化，但其相似度波動范圍較大（0.419～1.000，0.425～1.000，0.435～1.000），提示藥材質量受品種、生長環境氣候、產地等因素的影響較大。化學組分的差異即使采用相同工藝也會使中藥成品質量不同，應加強把控淫羊藿藥材的產地及加工方法。

為避免藥材本身質量的不穩定性會放大制備流程中間體（破壁粉）、成品（破壁飲片）樣品的差異性［19］，根據前期得到的各樣品的共有模式進行相關性分析，結果顯示其相似度較高（＞0.900），傳統飲片經破壁粉碎技術及成型技術制成破壁飲片成品的整個制備流程中對化學組分的影響較小，成分傳遞好，與鄧雯等［20］的研究結論一致。破壁過程中因高速滾動、摩擦，會產生大量的熱，有可能造成淫羊藿主要含有的黃酮類成分分解、轉化等，比較破壁前后淫羊藿黃酮類有效成分的含量之間的差異的研究鮮見報道。本研究結果表明，與傳統飲片相比，破壁粉、破壁飲片淫羊藿黃酮類有效成分的提取率可得到提高，同時含量無明顯差異。表明粉碎工藝的質量穩定、可靠，進一步提示淫羊藿利用該技術的可行性。

綜上所述，本研究中從定性與定量2個角度對淫羊藿破壁飲片的黃酮類成分進行分析，為了更全面地理解破壁飲片制備過程的質量變化規律，后續仍可對其物理性質、生物利用度等進行進一步研究。