AGTR1 過表達對肝細胞癌細胞株BEL-7404 生長的影響*

蔣會榮，黃 皓，李曉龍，張馨月，臺宗光，朱全剛，鮑蕾蕾，4△

（1. 蚌埠醫學院藥學院，安徽 蚌埠 233030； 2. 中國人民解放軍海軍軍醫大學第三附屬醫院，上海 200438；3. 上海市皮膚病醫院，上海 200443； 4. 中國人民解放軍海軍軍醫大學第一附屬醫院，上海 200433）

肝細胞癌（HCC）是原發性肝癌最常見的類型，由于其血管明顯異常，如動脈化和毛細血管化，導致血流異常、滲漏過多等［1-2］，認為是典型的血管生成性腫瘤［3］。LEVER 等［4］的一項針對患者服用血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）的回顧性研究發現，服用該類藥物患者患癌癥的風險更低，也證明了血管緊張素受體抑制劑（ARB）可降低患癌風險［5］。另外，發現腎素血管緊張素（Ang）系統中一個編碼血管緊張素Ⅱ1 型受體（AT1R）的基因AGTR1 在多種腫瘤中有異質性表達，且該基因的過表達會引起多種腫瘤（如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等）的不良預后［6-9］，但HCC 中AGTR1的表達情況及其對HCC 的影響尚不清楚。越來越多的研究表明，瞄準Ang Ⅱ/AT1R 軸可通過減少血管內皮生長因子A（VEGFA）的表達來抑制血管生成和減少血管滲透，從而抑制腫瘤細胞生長和轉移［10-12］。AGTR1可能通過增加VEGFA 的表達來促進腫瘤細胞的生長，同時抑制劑洛沙坦可通過抑制腫瘤血管的生成來影響腫瘤的生長。本研究中通過基因轉染技術構建了過表達AGTR1 的肝癌細胞，通過體內外實驗研究AGTR1 對腫瘤生長的影響，以及AGTR1 與VEGFA 表達的關系，同時考察AGTR1抑制劑洛沙坦在體內對血管生成的作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥、細胞株與動物

儀器：ABI 7300 型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI 公司）；Tannon 1600 型全自動數碼凝膠圖像分析系統（上海天能公司）；Thermo 240型CO2培養箱（美國Thermo 公司）；Olympus ck × 53 型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：RPMI 1640 培養基（美國Hyclone 公司，批號為SH30809.01B）；胎牛血清（法國Biowest 公司，批號為S1400）；0.25%Trypsin - EDTA（美國Gibco 公司，批號為15400054）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（日本Beyotime公司，批號為P0010）；SYBR Premix EX Taq（日本TaKaRa公司，批號為639676）；引物（上海生工生物工程有限公司，批號為B661104）；M - PER（批號為78501），T -PER（批號為78510），均購于美國Thermo 公司；AGTR1特異性一抗（美國Santa Cruz公司，批號為sc-29750）；三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，Cell Signaling Technology公司，批號為97166）；Plasmid Maxi Kit（E.Z.N.A公司，批號為D2485）；Cell Counting Kit - 8（CCK - 8）試劑盒（日本Dojindo 公司，批號為CK04）；Transwell 小室（美國Corning 公司，批號為Scipu001412）；Puromycin（德國Sigma 公司，批號為AB3258）；Isoflurane（深圳瑞沃德公司，批號為R510-22）；洛沙坦（MedChem Express，規格為1 g，批號為20170307）。

細胞株：BEL-7404肝癌細胞株購自ATCC細胞庫。

動物：6 周齡雄性BALB/ c 裸鼠（上海畢凱實驗動物公司，動物生產許可證號為SCXK ＜滬＞2013 -0016），于26 ℃條件下，置動物隔離器中飼養。

1.2 方法

TCGA 數據庫中獲取數據：通過網址https：// cancergenome.nih.gov/登陸TCGA 數據庫，檢索HCC RNA芯 片 數 據 集，下 載2018年1月5日至3月5日TCGA -2V - A95S～TCGA - G3 - A25S（374 肝癌RNA - Seq）和TCGA-BC-A10Q～TCGA-G3-A3CH（50 例癌旁樣本）的RNA-Seq及臨床數據，檢索AGTR1和VEGFA基因，并整理其表達值，同時進行相關性分析。

細胞培養與轉染：BEL-7404細胞置RPMI 1640培養基（含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素），并置含5% CO2的37 ℃培養箱中培養。取對數生長期的BEL -7404細胞，均勻接種至6孔板中培養（3×105個細胞/孔），待細胞生長至30%～50%時，將2 μg 質粒DNA 加入100 μL Opti-MEM 稀釋，將4 μL jetPEITM 加入100 μL Opti - MEM 稀釋，將稀釋后的jetPEITM 加入質粒稀釋液中，輕輕混勻，室溫孵育20～30 min。然后將200 μL混合液滴加至換有新鮮培養液的6 孔板中，輕輕混勻，置培養箱中培養。

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT - PCR）檢測基因表達：組織中RNA 采用TRIzol（Invitrogen）法提取，用Fast200 試劑盒提取細胞中mRNA。逆轉錄酶試劑盒的反應條件為42 ℃、20 min 和85 ℃、5 min。SYBR Green試劑盒用于qRT-PCR，反應條件為預變性95 ℃、30 s，40個循環（95 ℃、5 s，57 ℃、45 s，72 ℃、45 s），72 ℃、60 s。GAPDH作為內參，使用2-ΔΔCt法計算相對定量。引物序列為AGTR1（Sense ATCCCAGAAAGTCGGCACCAGATG，Anti - sense TGACTTTGGCTACAAGCATTGTGCG）；GAPDH（Sense GAGCGAGATCCCTCCAAAAT，Anti -sense RGGCTGTTGTCATACTTCTCATGG）。

蛋白免疫印跡法檢測細胞表達：收集細胞，離心（轉速為3500 r/min）5 min，向細胞中加入300 μL M-PER后4 ℃冰浴30 min（期間每10 min振蕩1次），離心（轉速為12000 r/min）15 min，收集蛋白質。采用BCA 法測定蛋白質濃度，定量后上樣，混勻，100 ℃加熱5 min，冷卻后上樣10 μL（50 μg蛋白/泳道）。將膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，并在室溫條件下用TBST封閉2 h，加入相應濃度的一抗，4 ℃孵育過夜；次日用TBST洗脫3次，每次15 min；加入二抗孵育1 h。加入顯影檢測試劑與膜蛋白充分混勻，室溫孵育5 min，用凝膠成像儀曝光并拍照。

CCK-8法檢測細胞增殖：收集細胞，以每孔100 μL（2× 103個細胞/孔）置96 孔板，每組重復6 個。將轉染細胞分別培養指定時間后加入CCK-8試劑，置37 ℃孵育2 h，測量450 nm波長處的吸光度（OD）值。

克隆形成實驗：將收集的細胞接種至50 mm 平皿中，接種單位為2000個細胞/皿，置培養箱中培養14 d，使用4%多聚甲醛溶液固定細胞15 min，再加入0.1%結晶紫液染色30 min，用清水清洗3 次，室溫風干后拍照并計數。

Transwell 法檢測細胞侵襲和遷移：用無血清的培養液將細胞置24 孔Transwell 板的上層小室中，將含有10%胎牛血清的培養基加入下層小室，設置3 個重復組，培養48 h 后取出上層小室，擦拭掉上層未穿過的細胞，用4%多聚甲醛溶液固定穿透細胞15 min，使用0.1%結晶紫染液染色30 min，使用倒置相差顯微鏡，隨機選擇5 個視野，計數被染成紫色的細胞數量。檢測細胞遷移和侵襲時，分別使用不含Matrixgel 膠和含Matrixgel 膠的Transwell小室，其他操作步驟一致。

腫瘤模型構建：利用胰酶將過表達AGTR1的BEL-7404 肝癌細胞消化，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細胞，置離心機中離心（轉速的1000 r/ min）5 min，用PBS 重懸細胞2 × 106個/ 100 μL，用胰島素針將細胞懸浮液注射入裸鼠的背部皮下。4 周后采用游標卡尺測量并記錄腫瘤體積，腫瘤體積按公式V=1/2×L×W2計算。

免疫組化：將石蠟切片，脫蠟，復水，蒸餾水沖洗后置PBS 中浸泡5 min，抗原修復后使用3% H2O2孵育15～20 min，從而消除內源性過氧物酶活性。滴加封閉液，于室溫下孵育15～20 min，添加適當稀釋比例的一抗，于4 ℃孵育過夜。使用PBS 沖洗3 次，每次3 min，添加二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min 后使用PBS 沖洗3 次，每次3 min，加入DAB 顯色液，蘇木素復染3 min，沖洗，脫水，透明，封片。

1.3 統計學處理

采用Graphpad 6.0統計學軟件分析。采用單因素方差分析進行組間差異的顯著性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC 中AGTR1 與VEGFA 表達的關系

374 例HCC 樣本數據集中，AGTR1 和VEGFA 具有一定相關性（r= 0.27，P＜0.0001），詳見圖1 A。分析AGTR1表達的前80例（n=high 80）和后80例（n=low 80）樣本與VEGFA的相關性，發現在AGTR1高表達（n=high 80）的樣本中，AGTR1 與VEGFA 的相關性增強（r= 0.46，P＜0.0001），詳見圖1 B；在AGTR1低表達（n=low 80）的樣本中，AGTR1 與VEGFA 無相關性（r=-0.00905，P=0.9365），詳見圖1 C。選擇HCC 細胞系BEL-7404細胞轉染AGTR1 和對照空載質粒，當AGTR1 表達量提高時，VEGFA 的蛋白水平顯著上調（P＜0.001），詳見圖1 D和圖1 E。

2.2 AGTR1 差異表達對BEL - 7404 細胞生長和體外轉移的影響

細胞生長：采用CCK-8法考察BEL-7404細胞轉染AGTR1 和對照空載質粒后細胞間活力的差異，結果BEL-7404 細胞組48 h 出現增殖差異（P＜0.05），隨著時間的延長差異更明顯（圖2 A），提示過表達AGTR1的BEL-7404 細胞的增殖能力較其對照空載細胞明顯增強。克隆形成實驗用于檢測BEL - 7404 細胞在過表達AGTR1和對照空載細胞的生長差異，發現過表達AGTR1的BEL-7404細胞的克隆形成能力較其對照空載細胞更強（圖2 B）。

體外轉移：采用Transwell 法檢測AGTR1 差異表達的BEL - 7404 細胞在遷移和侵襲能力方面的差異，考察AGTR1差異表達對BEL-7404細胞轉移能力的影響。結果表明，過表達AGTR1的BEL-7404細胞較其對照空載細胞的體外遷移和侵襲能力均顯著增強（P＜0.001）。詳見圖2 C和圖2 D。

2.3 抑制AGTR1 對VEGFA 表達的影響

HCC 數據集分析和實驗結果均表明，AGTR1 與VEGFA的表達在HCC細胞中存在相關性，且AGTR1的過表達能促進BEL-7404細胞的增殖和遷移。使用AGTR1抑制劑洛沙坦，在轉染前預先用50 μmol/ L 的洛沙坦處理細胞2 h，對BEL-7404細胞轉染AGTR1和對照空載質粒48 h 后，采用蛋白免疫印跡法考察細胞在洛沙坦處理后AGTR1和VEGFA蛋白的表達情況。結果發現，洛沙坦能不同程度地抑制AGTR1過表達的BEL-7404細胞中AGTR1 和VEGFA 的表達（P＜0.01），對AGTR1低表達的BEL - 7404 細胞中VEGFA 的表達無影響（P＞0.05）。詳見圖3 A至圖3 C。

2.4 抑制AGTR1 對腫瘤生長和血管形成的影響

采用過表達AGTR1 的BEL - 7404 細胞構建裸鼠皮下成瘤模型，成瘤1 周后，給予低、中、高劑量洛沙坦（20，40，80 mg / kg），4 周后測量腫瘤體積。結果顯示，洛沙坦可以抑制腫瘤的生長，劑量為20 mg / kg時，具有不同程度的生長抑制作用（P＜0.05）。詳見圖3 D 和圖3 E。

同樣按上述處理方式，采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測成瘤裸鼠血清VEGFA 水平，發現不同處理組間血清VEGFA 水平出現不同程度的差異，當洛沙坦劑量增至40 mg/kg時，血清VEGFA水平顯著下降（P＜0.05）。詳見圖3 F。為了進一步了解洛沙坦對腫瘤血管形成的影響，通過免疫組化法檢測CD31陽性細胞水平，考察其對腫瘤血管形成的影響。與對照組比較，不同劑量的洛沙坦可不同程度地抑制腫瘤血管形成。詳見圖3 G。

3 討論

血管生成的阻斷一直被認為是抑制腫瘤生長的有效機制。目前，大多數獲批的一線和二線晚期HCC 的治療目標是血管生成途徑［13］。VEGF/ VEGFRs 信號通路作為參與腫瘤血管生成的重要通路，已作為治療HCC 的藥物靶點［14-15］。VEGFA 是血管生成過程如內皮細胞增殖和遷移中最關鍵的配體［16-18］。因此，積極尋找有效的靶點抑制劑為肝癌患者的治療指明了新的方向，通過確定并檢測腫瘤標志物對有效診斷和治療肝癌的重要性也不容忽視［19-20］。

LI等［21］的研究發現，服用ACEI可降低患癌風險，但部分學者在相關研究中并未得到類似結果。甚至有研究發現，ARB 的使用可能會增加患癌風險［22］。上述研究結果的差異可能與患者的種族、服藥周期、數據處理方式等因素相關。結合本研究結果，洛沙坦在AGTR1過表達的患者中受益可能性更大，故應將患者個體的基因表達譜納入是否服用ACEI/ARB的考慮因素。本研究中發現，AGTR1 與VEGFA 的表達具有一定相關性，且在高表達AGTR1 的患者中相關性更強，洛沙坦可以抑制AGTR1過表達引起的VEGFA 表達上調，均表明AGTR1 過表達在HCC細胞增殖、侵襲、血管形成等方面具有重要作用。

綜上所述，AGTR1的過表達可促進HCC細胞的增殖、遷移和侵襲，其作用機制可能與增加VEGFA表達有關。洛沙坦作為靶向AGTR1 抑制劑，在一定程度上降低了VEGFA 的水平，可為ACEI 用于治療AGTR1 高表達的HCC患者提供參考。