治痤膠囊高效液相色譜指紋圖譜建立及多成分含量測定*

凌 驄，徐 斌，劉亮鏡，王 權

（安徽省蕪湖市中醫醫院，安徽 蕪湖 241000）

治痤膠囊為安徽省蕪湖市中醫醫院院內特色制劑（皖藥制字Z20050016），由金銀花、酒黃芩、焦梔子、赤芍、牡丹皮、丹參、夏枯草等12味中藥組方，具有清泄熱毒、化濕通腑功效，臨床用于治療熱毒血濁型濕疹［1］、痤瘡的效果顯著，對脂溢性皮炎、酒糟鼻及皮膚潰瘍亦有良好療效。其現行質量標準僅限定了丹酚酸B 含量，指標單一，專屬性差，難以保證質量和療效［2-4］。高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜具有整體性、特征性、可量化等特點，與中藥成分的復雜性、模糊性相適應，是公認的評價中藥制劑質量的可靠方法［5-7］。為進一步控制治痤膠囊質量的一致性和穩定性，本研究中建立了治痤膠囊的HPLC 指紋圖譜，并測定其中具有抗菌消炎活性作用的綠原酸、黃芩苷、梔子苷、芍藥苷、丹皮酚［8-13］的含量，以對該制劑的質量進行有效表征、綜合評價和全面控制。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent - 1200 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），配有G1314B 型可變波長檢測器；XP-205 型分析天平（精度為0.01 mg），AL - 204 型分析天平（精度為0.1 mg），均購自梅特勒- 托利多儀器有限公司；KQ -500DB 型數控超聲儀（上海博訊實業有限公司，功率為200～500 W，頻率為40 kHz）；UPS-11-10T 型純水機（成都優普凈化科技有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號為110753 - 201415，純度為96.2%），梔子苷對照品（批號為110749-201617，純度為98.4%），芍藥苷對照品（批號為110736-201741，純度為95.7%），黃芩苷對照品（批號為110715-201821，純度為95.4%），丹皮酚對照品（批號為110708 -201407，純度為99.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（分析純，美國Tedia Company公司）；磷酸（分析純，上海展云化工有限公司）；水為自制超純水；治痤膠囊（安徽省蕪湖市中醫醫院制劑室，批號分別為ZS201201，ZS201202，ZS201203，ZS210101，ZS210102，ZS210103，ZS210104，ZS210201，ZS210202，ZS210203，編號設為S1-S10）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件［14-20］

色譜柱：Waters XBridgeTM-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：330 nm（0～13.5 min，綠原酸），230 nm（13.5～42.0 min，梔子苷和芍藥苷），278 nm（42.0～60.0 min，黃芩苷和丹皮酚）；柱溫：20 ℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution procedure（%）

2.2 溶液制備

取綠原酸、梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和丹皮酚對照品各適量，分別加甲醇制成質量濃度為249.0，319.0，626.0，225.5，201.5 μg/ mL 的對照品貯備液；精密吸取此對照品貯備液1.0，1.0，0.5，2.5，0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得質量濃度分別為24.900，31.900，31.300，56.375，10.075 μg/ mL 的混合對照品溶液。取樣品（批號為ZS201201）1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入75%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率為350 W，頻率為40 kHz）30 min，放至室溫，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過；取續濾液2 mL，置5 mL容量瓶中，加75%甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。按樣品處方和制備工藝制備不含金銀花、焦梔子、赤芍、酒黃芩、牡丹皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 指紋圖譜建立

2.3.1 共有峰指認

精密吸取2.2 項下混合對照品溶液和供試品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，共標定16 個共有峰，根據保留時間指認出1號峰為綠原酸，2號峰為梔子苷，3 號峰為芍藥苷，4 號峰為黃芩苷，5 號峰為丹皮酚。詳見圖1。

2.3.2 方法學考察

精密度試驗：精密吸取2.2 項下供試品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次。以梔子苷峰為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD為0.12%～1.04%（n= 6），相對峰面積的RSD為0.20%～2.67%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取2.2 項下供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣測定。結果以梔子苷峰為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD為0.09%～0.42%（n=6），相對峰面積的RSD為0.32%～2.44%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號為ZS201201）適量，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果以梔子苷峰為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD為0.17%～1.75%（n= 6），相對峰面積的RSD為0.53%～2.72%（n= 6），表明方法重復性良好。

2.3.3 相似度評價

取10 批樣品（批號分別為ZS201201，ZS201202，ZS201203，ZS210101，ZS210102，ZS210103，ZS210104，ZS210201，ZS210202，ZS210203）各適量，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，將色譜數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）軟件，結果相似度分別為0.994，0.985，0.997，0.991，0.989，0.990，0.993，0.985，0.982，0.978。

2.4 含量測定

2.4.1 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取2.2 項下3 種溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

線性關系考察：精密吸取2.2項下芍藥苷和丹皮酚對照品貯備液各0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，梔子苷對照品貯備液0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，綠原酸對照品貯備液0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8 mL，黃芩苷對照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，分別配制成系列質量濃度的對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。以對照品溶液質量濃度為橫坐標（X，μg/mL）、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表2。

精密度試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果見表2，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于0，2，4，8，12，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果見表2，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

表2 線性關系考察及精密度、穩定性、重復性試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation，precision，stability and repeatability tests（n=6）

重復性試驗：取樣品（批號為ZS201201）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按外標法計算含量。結果見表2，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為ZS201201）0.5 g，精密稱定，平行6份，置50 mL容量瓶中，依次加入綠原酸、梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、丹皮酚對照品（質量濃度分別為0.7076，0.7199，0.5237，0.7403，0.7836 mg/mL）2.0，2.5，1.8，5.0，1.0 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算含量，并計算回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.4.2 樣品含量測定

取10 批樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定3次，記錄峰面積，并按外標法計算含量。結果見表4。

表4 樣品含量測定結果（mg/g，n=3）Tab.4 Results of content determination of five components in the samples（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

中藥制劑各成分的最大吸收波長不同，單波長下的色譜信號弱，積分誤差大，而不同基線的多波長檢測數據處理煩瑣［21-23］。故本研究中選用了可變波長紫外檢測器，根據目標成分的最大吸收波長，選擇了330 nm（綠原酸）、230 nm（芍藥苷和梔子苷）和278 nm（黃芩苷和丹皮酚）。磷酸溶液體積分數考察了0.1%，0.2%，0.4%，柱溫考察了20 ℃和25 ℃，綜合比較5 個待測成分色譜峰的分離度和對稱性，最終選擇0.2%磷酸溶液流動相和20 ℃柱溫。

3.2 提取溶劑選擇

提取溶劑考察了甲醇、75%甲醇、50%甲醇，三者色譜峰數量無差異，但75%甲醇提取時響應值最理想。故最終選擇75%甲醇為提取溶劑。

3.3 色譜峰數量與強度

建立指紋圖譜時，主要從5個待測成分色譜峰的分離度和分析時長考慮，流動相梯度洗脫至40%乙腈結束，樣品尚有部分極性較小的成分未被檢測到，導致色譜峰數量偏少；保留時間為30～40 min 時，有數個響應值較小的色譜峰，色譜峰積分面積的RSD大于5%，未列為共有峰。

3.4 一測多評法

本研究中嘗試以梔子苷為內標物，按斜率校正法和多點校正法計算其余成分含量，并采用SPSS 20.0 統計學軟件對各成分含量的3組數據進行t檢驗，結果2種一測多評法［24-25］與外標法所得綠原酸和丹皮酚含量均有顯著差異（P＜0.05），故未能建立樣品的一測多評法，最終僅采用指紋圖譜指認成分。