除脂祛濕生發丸質量標準研究*

普 娟，馬云淑，張貴華，梅佳華，高家菊，葉建州△

（1. 云南中醫藥大學中藥學院·云南省高校外用給藥系統與制劑技術研究重點實驗室·云南省南藥可持續利用重點實驗室，云南 昆明 650500； 2. 云南中醫藥大學第一附屬醫院，云南 昆明 650021）

脂溢性脫發由雄激素及其受體異常引起，中醫稱為“發蛀脫發”“蛀發癬”，為皮膚科臨床常見病與多發病［1-3］。除脂祛濕生發方為云南某醫院治療脂溢性脫發的臨床經驗方，原為湯劑，為擴大臨床使用范圍和提高患者用藥依從性，擬開發為丸劑。由菟絲子、枸杞子、地黃、當歸、茯苓等9 味中藥組方，具有清肺胃之陰、養陰補腎功效。前期研究中已完成除脂祛濕生發丸的制備工藝優化，本研究中建立了制劑的質量標準，以期為后續自動化生產提供質量保障。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 Infinity 型高效液相色譜儀（美國Aglient 科技有限公司）；SB-4200 DTD 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；101-2AB 型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；薄層層析硅膠G板（青島海洋化工廠）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四青生化材料廠）；R2000-30型電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司，精度為十萬分之一）；SY-30 型四用片劑測定儀（鄭州南北儀器設備有限公司）。

1.2 試藥

除脂祛濕生發丸（實驗室自制，批號分別為20191101，20191102，20191103，規格為每丸0.06 g）；金絲桃苷對照品（批號為111521 - 201809）、阿魏酸對照品（批號為110773 - 201915）純度均大于98%，生地黃對照藥材（批號為121180-201506），茯苓對照藥材（批號為121117 - 201509），枸杞子對照藥材（批號為121072-201611），當歸對照藥材（批號為120927-201517），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇（色譜純，德國默克公司）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 外觀性狀

本品外觀呈棕褐色，氣微，味微苦。

2.2 薄層色譜（TLC）鑒別

菟絲子：分別取3 批樣品各適量，研細，取粉末2 g，加甲醇40 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，蒸干，殘渣加甲醇1 mL，作為供試品溶液。取金絲桃苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。按處方和制備工藝制備不含菟絲子的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮- 甲酸- 水（20∶2∶1.5∶2，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%三氯化鋁溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同黃色熒光斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 A。

枸杞子：分別取3 批樣品各適量，研細，取粉末1 g，加水35 mL，加熱煮沸15 min，放冷，濾過，濾液用乙酸乙酯15 mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，濃縮至1 mL，作為供試品溶液。同法制備對照藥材溶液。按處方和制備工藝制備不含枸杞子的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷（3∶2，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同黃色熒光斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 B。

生地黃：分別取3 批樣品各適量，研細，取粉末4 g，加水60 mL，煎煮30 min，放冷，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL，作為供試品溶液。同法制備對照藥材溶液。按處方和制備工藝制備不含生地黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液［3］。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以二甲苯- 乙酸乙酯（2∶3，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 C。

當歸：分別取3 批樣品各適量，研細，取粉末1 g，加甲醇20 mL，超聲（功率為200 W，頻率為40 kHz）15 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。同法制備當歸對照藥材溶液。按處方和制備工藝制備不含當歸的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（8∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同黃色熒光斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 D。

茯苓：分別取3批樣品各適量，研細，取粉末1 g，加乙醚50 mL，超聲（功率為200 W，頻率為40 kHz）10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。同法制備對照藥材溶液。按處方和制備工藝制備不含當歸的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述溶液各15 μL，以甲苯- 乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同斑點，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 E。

2.3 一般檢查

按2020年版《中國藥典（四部）》通則0108 丸劑項下規定對3 批（批號分別為20191101，20191102，20191103）樣品進行檢驗，結果均符合規定。詳見表1。

表1 3批樣品檢查結果Tab.1 Determination results of the three batches of samples

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78，V/V，金絲桃苷）和甲醇- 1%醋酸溶液（25∶75，V/V，阿魏酸）；流速：1.0 mL/ min；柱溫：30 ℃；檢測波長：360 nm（金絲桃苷）和316 nm（阿魏酸）；進樣量：5 μL。理論板數按金絲桃苷和阿魏酸峰計均不低于5000。

2.4.2 溶液制備

對照品溶液：分別取金絲桃苷對照品10 mg、阿魏酸對照品12 mg，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為1 mg/ mL 的金絲桃苷對照品母液、1.2 mg/ mL 的阿魏酸對照品母液；分別精密量取上述溶液560 μL 和334 μL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇制成質量濃度為22.40 μg/mL 的金絲桃苷對照品溶液、16.032 μg/mL的阿魏酸對照品溶液。

供試品溶液：取3 批樣品各適量，研細，取粉末5 g，精密稱定，加甲醇溶解，超聲30 min，搖勻，用甲醇定容至50 mL 容量瓶中，作為金絲桃苷供試品溶液。取粉末2 g，精密稱定，加70%甲醇25 mL，穩定質量，超聲（功率為200 W，頻率為40 kHz）30 min，補足減失的質量，作為阿魏酸供試品溶液。

陰性對照品溶液：按處方工藝取缺菟絲子和當歸的其他藥材，按供試品溶液制備方法制備缺菟絲子和當歸的陰性對照品溶液。

2.4.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.4.2項下6種溶液，按2.4.1項下色譜條件進樣測定。結果供試品溶液色譜與對照品溶液色譜主峰相同，且陰性對照品溶液色譜相同位置處無吸收，對測定無干擾。色譜圖見圖2。

線性關系考察：分別精密吸取2.4.2項下金絲桃苷對照品溶液1，2，4，6，8，10，12 μL，阿魏酸對照品溶液1，2，5，10，15，20，25 μL，按2.4.1項下色譜條件依次進樣測定，記錄峰面積。以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y金=34.053X金+ 1.2166（r= 0.9991，n= 7）、Y阿=76.369X阿- 0.8743（r= 1.0000，n= 7）。結果表明，金絲桃苷、阿魏酸進樣量分別在0.021～0.270 μg 和0.016～0.400 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.4.2 項下金絲桃苷、阿魏酸對照品溶液各適量，按2.4.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果金絲桃苷、阿魏酸峰面積的RSD分別為0.54%和0.15%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為20191101）適量，按2.4.2 項下方法配制供試品溶液，共6 份，按2.4.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果金絲桃苷、阿魏酸峰面積的RSD分別為1.07%和0.08%（n= 6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為20191101）適量，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，12，16，20，24 h 時按2.4.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果金絲桃苷、阿魏酸峰面積的RSD分別為0.92%和0.07%（n= 7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20191101），共6 份，精密稱定，分別加入金絲桃苷對照品0.55 mg、阿魏酸對照品0.18 mg，按2.4.2 項下方法制備供試品溶液，按2.4.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4.4 樣品含量測定

取3 批樣品，按2.4.2 項下方法制備供試品溶液，按2.4.1 項下色譜條件進樣測定3 次，記錄峰面積，并計算含量。結果見表3。

表3 3批樣品中金絲桃苷和阿魏酸含量測定結果（n=3）Tab.3 Results of content determination of hyperoside and ferulic acid in the three batches of samples（n=3）

3 討論

3.1 TLC 條件篩選

菟絲子：2020年版《中國藥典（一部）》中菟絲子鑒別以聚酰胺薄膜為固定相，但聚酰胺薄膜載體是塑料，易皺曲，難以平穩放入展開缸內，導致色譜效果差。故選擇硅膠G 薄層板，以乙酸乙酯- 丙酮- 甲酸- 水（20∶2∶1.5∶2，V/V/V/V）為展開劑，噴以10%三氯化鋁溶液顯色，斑點清晰，專屬性較好。

枸杞子：2020年版《中國藥典（一部）》中枸杞子的色譜條件為乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3∶2∶1，V/V/V），實際上斑點比移值過高，降低甲酸比例后也未能改善。故選擇乙酸乙酯-三氯甲烷（3∶2，V/V）為展開劑，斑點清晰，專屬性良好，比移值適中。

生地黃：分別采用加熱回流、甲醇超聲后乙酸乙酯萃取和水提取后乙酸乙酯萃取3種方法提取生地黃，結果水提取后再用乙酸乙酯萃取所得色譜圖斑點清晰、分離效果良好，且陰性對照無干擾。2020年版《中國藥典（一部）》中生地黃鑒別以梓醇為指標性成分，但采用不同提取方法和展開系統均未能檢出梓醇。查閱文獻［4-8］，發現在加工炮制過程中，生地黃中梓醇的含量會大幅度下降，甚至無法測定，較難鑒別。故選擇生地黃藥材作為對照。

當歸：曾考察碳酸氫鈉超聲后稀鹽酸調節pH，再用乙醚萃取，以及單用甲醇超聲處理，結果所得色譜圖峰形相近［9］。故選擇甲醇超聲處理15 min制備供試品溶液。

茯苓：曾考察甲苯- 乙酸乙酯- 甲酸、石油醚（60～90 ℃）- 甲酸乙酯- 甲酸2 種展開系統，結果前者展開效果更佳，斑點較清晰；曾考察不同顯色方法［在紫外光燈（365 nm）下檢視、用10%硫酸乙醇］，結果在365 nm波長下檢視陰性對照有干擾。故選擇甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.1，V/V/V）為展開劑，10%硫酸乙醇溶液顯色，特征斑點較清晰，且陰性對照無干擾。

3.2 含量測定流動相、提取方法選擇

金絲桃苷：2020年版《中國藥典（一部）》中菟絲子的指標性成分金絲桃苷色譜條件為乙腈- 0.1%磷酸溶液（17∶83，V/V），所得色譜圖基線平穩，但峰形不理想，各組分分離效果不佳。反復篩選條件，考察不同配比流動相（20∶80，21∶79，V/V），最終確定流動相為乙腈- 0.1%磷酸溶液（22∶78，V/V），色譜圖峰形較好，且各組分分離效果較佳，保留時間適宜，方法專屬性強。

阿魏酸：2020年版《中國藥典（一部）》中當歸指標性成分阿魏酸色譜條件為乙腈- 0.085%磷酸溶液（17∶83，V/V），所得色譜峰拖尾嚴重，分離度不好。曾考察甲醇-水、甲醇-1%醋酸溶液（40∶60，V/V）等流動相體系，結果甲醇-1%醋酸溶液（25∶75，V/V）作為流動相時峰形較好，分離效果較佳，保留時間適宜［10-11］。同時，以超聲、回流、超聲后萃取等方法提取阿魏酸，發現以超聲處理30 min時各色譜峰分離更佳，峰形較好。