高效液相色譜-質譜法同時測定復合維生素B 片中5 種成分含量

李 姮，李 玲，吳 琦，陳乃江

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222006）

復合維生素B 片主要含有維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺和泛酸鈣，用于預防和治療B 族維生素缺乏所致營養不良、厭食、腳氣病、糙皮病等。截至2021年5月，我國共有復合維生素B 片批準文號103個。其標準收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·化學藥品及制劑（第一冊）》［WS1-73（B）-89］，分別采用重量法、紫外分光光度法和凱氏定氮法測定維生素B1、維生素B2和煙酰胺的含量，但存在操作復雜、步驟煩瑣、專屬性差等問題［1］。曾采用高效液相色譜- 紫外光譜（HPLC - UV）法、高效液相色譜- 二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法［2-7］、核磁共振法［8］、毛細管電泳法［9］測定復合維生素B片中的成分，但部分成分在C18柱中保留較差，部分成分紫外吸收較弱，很難使復合維生素B片中5 種成分達到良好分離。QDa 是一種操作簡單、維護方便的小型質譜檢測器，被廣泛應用于化學成分［10-14］和農藥殘留［15］的快速測定。本研究中應用此檢測器，采用高效液相色譜- 質譜（HPLC - MS）法同時測定復合維生素B 片中5 種成分的含量，為提高其質量標準提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Alliance e2695 型高效液相色譜儀、Waters Acquity QDa 型質譜儀（美國Waters 公司）；Sartorius BP211D型分析天平（德國Sartorius公司，精度為0.01 mg）；KH -700DE 型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司，功率為700 W，頻率為40 kHz）；Milli - Q 型超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

復合維生素B 片（天津力生制藥股份有限公司，批號分別為1804010 和1905019；南京白敬宇制藥有限責任公司，批號為190751；規格均為每片分別含維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺、泛酸鈣3.0，1.5，0.2，10.0，1.0 mg）；維生素B1標準品（批號為100390 -201806，含量為97.9%），維生素B2標準品（批號為100396-201905，含量為98.2%），維生素B6標準品（批號為100116 - 201906，含量為99.9%），煙酰胺標準品（批號為100115-202005，含量為99.9%），泛酸鈣標準品（批號為100370-201903，含量為96.8%），均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氨水（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

1）色譜條件

色譜柱：Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈- 0.1%甲酸溶液（50∶50，V/V）；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2）質譜條件

離子源：電噴霧離子（ESI）；離子化模式：正離子模式；單離子記錄（SIR）模式下掃描；錐孔電壓：15 V；毛細管電壓：0.8 kV；探頭溫度：600 ℃；維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺和泛酸鈣的質荷比（m/z）分別為265，377，170，123，220，均為定量離子。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取維生素B1、維生素B6和泛酸鈣對照品各適量，精密稱定，加0.1%甲酸溶液制成質量濃度為400 μg/mL 的對照品貯備液Ⅰ；取煙酰胺對照品適量，精密稱定，加0.1%甲酸溶液制成質量濃度為200 μg/mL 的對照品貯備液Ⅱ；取維生素B2對照品適量，精密稱定，加5%氨水溶液制成質量濃度為600 μg/mL的對照品貯備液Ⅲ。分別精密量對照品貯備液Ⅰ、對照品貯備液Ⅱ、對照品貯備液Ⅲ各適量，置100 mL 容量瓶中，制成每1 mL 含維生素B120.94 μg、維生素B259.80 μg、維生素B68.78 μg、煙酰胺9.85 μg、泛酸鈣41.84 μg的混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品20片，精密稱定，研細，取粉末適量（約相當于維生素B13 mg），精密稱定，置100 mL容量瓶中，加0.1%甲酸溶液適量，超聲（功率為700 W，頻率為40 kHz）10 min，放冷，稱定質量，用0.1%甲酸溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液1 mL，置50 mL 容量瓶中，用0.1%甲酸溶液定容，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學考察

線性關系考察：吸取2.2項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋成系列質量濃度的溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，剔除超限濃度，以溶液質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、各組分定量離子的峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系考察結果Tab.1 Results of the linear relation test

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液（維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺和泛酸鈣的質量濃度分別為0.6544，1.8688，0.2744，0.3078，1.3075 μg/mL）適量，按2.1 項下試驗條件連續進樣測定6 次，記錄各組分定量離子的峰面積。結果維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺和泛酸鈣成分定量離子峰面積的RSD分別為1.89%，2.83%，3.46%，3.14%，2.68%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為1804010）樣品適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1項下試驗條件進樣測定。結果維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺和泛酸鈣含量的RSD分別為2.01%，2.53%，3.11%，3.25%，2.74%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為1804010）樣品適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 時按2.1 項下試驗條件進樣測定。結果維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺和泛酸鈣定量離子峰面積的RSD分別為2.15%，3.09%，2.86%，3.22%，3.31%（n= 6），表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為1804010）粉末適量，精密稱定，共6份，分別精密加入混合對照品溶液，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3 批（批號分別為1804010，190751，1905019）樣品，各3 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，按外標法計算含量。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of five components in the samples（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 溶劑選擇

在制備對照品溶液的過程中發現，維生素B1、維生素B6、煙酰胺和泛酸鈣能完全溶解于0.1%甲酸溶液，但維生素B2不能，將維生素B2的溶劑改為5%氨水溶液后能完全溶解。故制備對照品溶液時選擇不同溶劑。

3.2 檢測器選擇

復合維生素B 片中的5 種成分極性較大，在C18柱上的保留和分離度均較差，泛酸鈣的紫外最大吸收波長小于200 nm，接近甲醇和乙腈等有機溶劑的截止波長，受流動相干擾較大，故不宜采用HPLC-UV 法同時測定5 個成分。本研究中采用HPLC -MS 法測定，配備QDa 小型質譜檢測器進行試驗，其價格低廉，維護保養成本低，操作簡便，較HPLC - UV 法或HPLC - DAD 法具有靈敏度高、專屬性強、檢測時間短等優點。

3.3 質譜條件選擇

比較了正、負2 種離子模式，發現正離子模式下待測物較易電離；考察每個化合物的錐孔電壓（9，11，13，15，18，21 V），結果錐孔電壓為15 V 時待測物的色譜峰峰形較好，靈敏度較高；當流速為0.6 mL/min 時，考察不同毛細管電壓（0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1 kV），結果毛細管電壓為0.8 kV 時色譜峰峰形較好，靈敏度較高。故最終確定MS 條件為正離子模式，錐孔電壓15 V，毛細管電壓0.8 kV。

3.4 方法評價

本研究中建立的HPLC - MS 法操作簡便、結果準確、重復性好，可用于同時測定復合維生素B 片中5 種成分的含量，可為提高其質量標準提供參考。