重組人胰島素注射液中異天冬氨酸含量檢測*

李 恒，晏菊姣，范曉磊，宋德芳，吳健鴻△，周朝暉

（1. 武漢藥品醫(yī)療器械檢驗所，湖北 武漢 430075； 2. 東北大學化學與生物化學系·巴奈特化學與生物分析研究所，美國 波士頓 02115）

脫酰胺化是常見的蛋白翻譯后修飾形式，普遍存在于蛋白、多肽類藥物中。藥物蛋白在生產(chǎn)、存儲過程中天冬酰胺（Asn）殘基發(fā)生非酶催化脫酰胺反應(yīng)［1］，產(chǎn)生特異性降解產(chǎn)物異天冬氨酸（isoAsp），可改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能［2-3］，并可能導致蛋白活性下降［4-5］。重組人胰島素由51 個氨基酸組成，含有3 個天冬酰胺殘基，Asn21位點易發(fā)生脫酰胺反應(yīng)［6］，2020年版《中國藥典（三部）》中對A21脫氨人胰島素進行了雜質(zhì)控制［7］。目前，胰島素注射液質(zhì)量標準的逐步提升使其制劑工藝不斷改進，其質(zhì)量顯著提高。蛋白的脫酰胺化研究已列入生物技術(shù)藥物質(zhì)量控制的相關(guān)內(nèi)容［1］。本研究中應(yīng)用IsoQuant?定量試劑盒，建立了測定重組人胰島素注射液中脫酰胺產(chǎn)物isoAsp 含量的高效液相色譜（HPLC）法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；XS205BU型電子天平（精度為0.01 mg），Mettler SevenEasy 型pH 計，均購于梅特勒- 托利多儀器公司；Classic型超純水機（Elga 公司）；Vortex-Kylin-Bell 5 型渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；DK - S26 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；SK250LHC 型超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為50 kHz）；R1750R 型高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；AP -9928-3型真空泵（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

重組人胰島素注射液［諾和諾德（中國）制藥有限公司，商品名諾和靈?，批號分別為2020010192 和2020061612，規(guī)格為300 IU/ 3 mL（筆芯），質(zhì)量濃度為3.5 mg/ mL］；重組人胰島素標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為140633-201907，含量為27.2 IU/mg）；IsoQuant?定量試劑盒［美國Promega 公司，貨號為MA1010，批號為0000387327，S- 腺苷-L- 高半胱氨酸（SAH）含量為14.97 μmol/ L，IsoAsp - DSIP 含量為96.1 μmol/ L，S- 腺苷-L- 甲硫氨酸（SAM）含量為1 mmol/L，異天冬氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PIMT），5 倍反應(yīng)緩沖液，0.3 mol/ L 磷酸］；磷酸二氫鉀（批號為20190509）、磷酸氫二鉀（批號為20180109）、無水硫酸鈉（批號為20181023）、磷酸（批號為20160425）、乙醇胺（批號為20200807），均為分析純，鹽酸（優(yōu)級純，批號為20190118），均購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜純，Scharlau公司，批號為20277613）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 法測定isoAsp 含量

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate?XB - C18柱（100 mm ×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；采用二極管陣列檢測器（DAD）；檢測波長：260 nm；進樣量：40 μL；柱溫：25 ℃；流動相：10%甲醇溶液（含7.9 mmol/L 磷酸二氫鉀和1.1 mmol/L磷酸氫二鉀，用磷酸調(diào)pH至6.2，A）-甲醇（B），梯度洗脫（程序見表1）。

表1 梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution procedure（%）

2.1.2 溶液制備

SAH 對照品溶液：取IsoQuant?定量試劑盒，于室溫放置30 min 解凍，取試劑盒中SAH 對照品（濃度為14.97 μmol/L），分別精密吸取0.5，1.0，2.0，3.0，5.0，10.0 μL，置200 μL進樣瓶中，加水稀釋至60 μL，制備含量分別為0.125，0.250，0.500，0.750，1.250，2.500 μmol/L的系列SAH對照品溶液。

isoAsp - DSIP 質(zhì)控對照溶液：取IsoQuant?定量試劑盒，于室溫放置30 min 解凍，取試劑盒中的IsoAsp -DSIP質(zhì)控對照品濃度為96.1 μmol/L），精密吸取2 μL，置200 μL 離心管中，加水稀釋至50 μL，得濃度為3.84 μmol/L的isoASP-DSIP質(zhì)控對照溶液。

酶反應(yīng)溶液：取重組人胰島素注射液（批號為2020010192），取上述isoAsp - DSIP 質(zhì)控對照溶液（濃度為3.84 μmol/L）和水（空白）各10 μL，分別置200 μL離心管中，平行2 份，各加入主反應(yīng)混合物（MM）溶液［水-5倍反應(yīng)緩沖液-SAM-PIMT（1∶1∶1∶1，V/V/V/V）］40 μL，輕輕渦旋并離心（轉(zhuǎn)速為12000 r/min），以確保液體均在管底。將離心管放置在30 ℃的水浴中30 min，取出，置冰上，加終止液（0.3 mol/ L 磷酸）10 μL，放置5～10 min 至反應(yīng)完全，輕輕渦旋并離心（4 ℃，轉(zhuǎn)速為12000 r/ min），取上清液，置200 μL 進樣瓶中，4 ℃避光保存。

2.1.3 測定法

取SAH 對照品溶液（濃度為1.25 μmol/ L），以及參與酶反應(yīng)的供試品溶液、isoAsp - DSIP 質(zhì)控對照溶液、水（空白）各40 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。用標準曲線計算樣品中SAH 的含量，酶反應(yīng)溶液中測得1 mol SAH 相當于樣品中蛋白含有1 mol isoAsp，以此計算重組人胰島素注射液和IsoAsp-DSIP 質(zhì)控對照溶液中蛋白的isoAsp含量。色譜圖見圖1。

2.1.4 方法學考察

線性關(guān)系考察：分別取2.1.2項下系列SAH對照品溶液各40 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以SAH進樣量（X，pmol）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.8667X+0.3613（R2=0.9997）。結(jié)果表明，SAH 進樣量在5～100 pmol 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度及穩(wěn)定性試驗：取2.1.2 項下濃度為1.25 μmol/L的SAH對照品溶液40 μL，分別于開始（0 h）、中間（5 h）和結(jié)束（10 h）時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定2次。結(jié)果SAH峰保留時間和峰面積平均值分別為3.96 min和43.57，RSD分別為0.11%和0.33%（n=6）。

重復性試驗：取樣品（批號為2020010192）適量，按2.1.2項下酶反應(yīng)溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，用標準曲線計算含量。結(jié)果isoAsp 含量的平均值為3.46 nmol/mL，RSD為5.10%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取2.1.2項下酶反應(yīng)溶液與SAH對照品溶液各30 μL，混勻，即得添加SAH 對照品濃度分別為0.25，0.75，1.25 μmol/L 的低、中、高水平加樣回收溶液，平行3 份，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定SAH的含量，并計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

靈敏度考察：取2.1.2 項下SAH 對照品溶液（濃度為0.125 μmol/ L），按2.1.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果色譜峰的信噪比（S/N）為15.9，符合定量要求。

2.2 法定標準A21 脫氨人胰島素測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate?XB - C18柱（100 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：以0.2 mol/ L 硫酸鹽緩沖液（取無水硫酸鈉28.4 g，加水溶解，加磷酸2.7 mL、水800 mL，用乙醇胺調(diào)pH 至2.3，加水至1000 mL）- 乙腈（82∶18，V/V）為流動相A，以乙腈-水（50∶50，V/V）為流動相B，梯度洗脫（程序見表3）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：214 nm；進樣量：20 μL。

表3 梯度洗脫程序（%）Tab.3 Gradient elution procedure（%）

2.2.2 溶液制備

系統(tǒng)適用性試驗溶液：取重組人胰島素標準品，加0.01 mol/L 鹽酸溶液溶解，稀釋成每1 mL 含1 mg 的溶液，室溫放置至少24 h。

供試品溶液：取重組人胰島素注射液，每1 mL中加9.6 mol/L鹽酸溶液3 μL，即得（相當于人胰島素70 μg）。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取2.2.2 項下系統(tǒng)適用性試驗溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，調(diào)節(jié)流動相比例使重組人胰島素主峰的保留時間約為25 min，重組人胰島素峰和A21脫氨人胰島素峰（與重組人胰島素峰的相對保留時間約為1.3）的分離度不小于1.8，拖尾因子不大于1.8。另取2.2.2 項下供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，除去苯酚峰或間甲基苯酚峰，按峰面積歸一化法計算A21脫氨人胰島素含量。色譜圖見圖2。

2.3 樣品含量測定

對不同批次的樣品蛋白進行isoAsp與A21脫氨人胰島素含量測定，結(jié)果見表4。

表4 isoAsp和A21脫氨人胰島素含量測定結(jié)果Tab.4 Results of content determination of isoAsp and A21 desamido human insulin

3 討論

隨著生物技術(shù)藥物在我國的發(fā)展，蛋白藥物的質(zhì)量控制越來越嚴格，脫酰胺化越來越受到關(guān)注［1］，關(guān)于蛋白藥物中isoAsp的研究越來越多［8-10］。isoAsp的產(chǎn)生是動態(tài)變化的過程［11-14］，建立準確、定量的檢測方法非常必要。

本研究中應(yīng)用IsoQuant?定量試劑盒中的PIMT 催化SAM 上的甲基移至樣品蛋白中isoAsp 的羧基上，而SAM 轉(zhuǎn)變?yōu)镾AH［1］，反應(yīng)中SAM，SAH，isoAsp 的摩爾比為1∶1∶1，即可通過測定SAH 而測定蛋白中isoAsp。為保證結(jié)果的準確性，需特別注意溶液配制、酶反應(yīng)操作過程的精確度。重組人胰島素注射液和isoAsp -DSIP 質(zhì)控對照溶液中SAH 含量均在5～100 pmol 線性范圍內(nèi)；加入isoAsp - DSIP 質(zhì)控對照溶液（濃度為3.84 μmol/ L，理 論 值 為25.63 pmol），其 平 均 值 為27.80 pmo（l+8.5%），符合要求（±10%）。本研究中所建立的方法操作簡便、測定快速、檢測有效、結(jié)果準確。

曾對重組人胰島素對照品中的isoAsp進行測定，結(jié)果未檢測到。可能原因是對照品為粉末，在-18 ℃溫度下于棕色瓶中保存，脫酰胺化不易發(fā)生；重組人胰島素注射液中檢測到isoAsp，樣品為液體，且保存條件通常為2～8 ℃，易發(fā)生脫酰胺化。由表4 可知，2 批重組人胰島素注射液蛋白中isoAsp 含量測定結(jié)果高于藥典方法測得A21脫氨人胰島素含量，表明重組人胰島素注射液中發(fā)生脫酰胺的位點除Asn21 外，還存在其他位點［15］，該結(jié)果是對制劑中蛋白脫酰胺化程度的整體評價。isoAsp不同于脫氨人胰島素，現(xiàn)行法定檢驗方法有關(guān)物質(zhì)A21脫氨人胰島素不能真實反映重組人胰島素注射液中蛋白的脫酰胺化程度，更不能表達isoAsp的情況。

綜上所述，所建立的方法能較全面地反映重組人胰島素注射液中胰島素蛋白脫酰胺化后產(chǎn)生isoAsp 的含量，可作為法定標準中雜質(zhì)A21脫氨人胰島素檢驗的補充，以更好地控制其質(zhì)量。