山東省市售龍膽瀉肝丸（水丸）質(zhì)量分析

李俊卿，王金鳳，李占芳，宋建建，崔洋洋，路公靜

（1. 山東省東營(yíng)市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 東營(yíng) 257091； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

龍膽瀉肝丸處方源自《醫(yī)方集解》，由龍膽、炙甘草、梔子（炒）、黃芩、澤瀉、木通、鹽車前子、柴胡、酒當(dāng)歸、地黃10 味中藥材組方，具有清肝膽、利濕熱功效［1］，廣泛用于慢性膽囊炎、急性帶狀皰疹、慢性前列腺炎等疾病的治療［2-3］。為加強(qiáng)藥品質(zhì)量監(jiān)督管理，客觀評(píng)價(jià)和提高山東省龍膽瀉肝丸的質(zhì)量，保障廣大人民群眾的用藥安全［4-8］，根據(jù)《山東省藥品監(jiān)督管理局關(guān)于印發(fā)2020年山東省藥品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作方案的通知》（局函〔2020〕76 號(hào)）及《2020年山東省藥品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作方案》（魯食藥檢業(yè)〔2020〕36 號(hào)）要求，開(kāi)展龍膽瀉肝丸（水丸）質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)研究。本研究中采用2015年版《中國(guó)藥典（一部）》標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與探索性研究相結(jié)合的方法，對(duì)從山東省12 個(gè)地市抽取的30 批龍膽瀉肝丸（水丸）進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，并提出合理化建議，以進(jìn)一步加強(qiáng)龍膽瀉肝丸（水丸）的監(jiān)督管理?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 樣品信息及檢驗(yàn)依據(jù)

龍膽瀉肝丸（水丸）來(lái)源于山東省的12 個(gè)地市，涉及藥品生產(chǎn)企業(yè)14 家，共30 批樣品，樣品信息見(jiàn)表1。所有樣品生產(chǎn)日期均為2020年12月31日前，故按照2015年版《中國(guó)藥典（一部）》進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)項(xiàng)目包括性狀、鑒別、水分、裝量差異、溶散時(shí)限、微生物限度和含量測(cè)定。

表1 龍膽瀉肝丸（水丸）樣品信息Tab.1 Information of Longdan Xiegan Pills（Water-Bindered Pills）samples

2 方法與結(jié)果

2.1 法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)

性狀：依據(jù)法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)為暗黃色水丸，味苦。結(jié)果30 批樣品均為暗黃色，味苦，顏色略有差異，但均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

鑒別：依據(jù)法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，包括顯微鑒別1 項(xiàng)和薄層色譜鑒別3 項(xiàng)。結(jié)果30 批樣品均顯示其顯微特征，薄層色譜圖中均有相應(yīng)特征斑點(diǎn)出現(xiàn)，均符合規(guī)定。

水分：依據(jù)法法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，水分應(yīng)不得過(guò)9.0%。結(jié)果30批樣品的水分為2.7%～7.6%，均符合規(guī)定。

裝量差異：依據(jù)法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，超出裝量差異限度的不得多于2袋（瓶），并不得有1袋（瓶）超出限度1倍。結(jié)果30批樣品均符合規(guī)定。

溶散時(shí)限：依據(jù)法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)在1 h 內(nèi)完全溶散。結(jié)果30 批樣品的溶散時(shí)限為31～59 min，均符合規(guī)定。

微生物限度：依據(jù)法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果30批樣品均符合規(guī)定。

含量測(cè)定：依據(jù)法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，本品每1 g 含龍膽以龍膽苦苷（C16H20O9）計(jì)，不得少于0.80 mg；含梔子以梔子苷（C17H24O10）計(jì)，不得少于1.30 mg；含黃芩以黃芩苷（C21H18O11）計(jì)，不得少于3.80 mg。結(jié)果龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的含量分別為1.36～6.31 mg/ g、2.24～3.77 mg/g、4.53～9.49 mg/g，均符合規(guī)定。可見(jiàn)，30批樣品含量有一定差異，可能與生產(chǎn)工藝、投料量和飲片質(zhì)量有關(guān)。

2.2 探索性研究

2.2.1 儀器與試藥

儀器：島津LC - 20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；7900 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（安捷倫科技有限公司）；MARS6240/50 型微波消解儀（美國(guó)CEM公司）；BT224S 型分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為萬(wàn)分之一）。

試藥：龍膽瀉肝丸（樣品信息見(jiàn)表1）；硝酸（分析純，太倉(cāng)滬試試劑有限公司，批號(hào)為20191219）；乙腈（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20201203）；水為超純水；23-乙酰澤瀉醇B 對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111846-201504，純度為100%）；砷（As）、鎘（Cd）、鉻、鉛（Pb）多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液［GNM-M041940-2013，批號(hào)為20D3577，質(zhì)量濃度為1000 μg/mL］，金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液［GNM-SAU-003-2013，批號(hào)為19D6574，質(zhì)量濃度為1.0 μg/ mL］，鍺、銦、鉍多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（GNM - M033030 - 2013，批號(hào)為2D3605，質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL），均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；汞（Hg）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液［GBW（E）080124，批號(hào)為19052］，銅（Cu）單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液［GBW（E）080122，批號(hào)為19101］，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，均購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

2.2.2 高效液相色譜法測(cè)定23 - 乙酰澤瀉醇B 含量

1）色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（75∶25，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：208 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2）溶液制備

取23 - 乙酰澤瀉醇B 對(duì)照品10 mg，精密稱定，加乙腈制成質(zhì)量濃度為100 μg/ mL 的對(duì)照品貯備液。取樣品適量，研細(xì)，取2 g，精密稱定，置具塞平底燒瓶中，加入乙腈20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率為300 W，頻率為50 kHz）45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用乙腈補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

3）方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：吸取溶液制備項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.2，0.4，0.8，1.0，2.0，3.0，5.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加乙腈稀釋并定容，制成質(zhì)量濃度分別為2.086，4.172，8.344，10.430，20.860，31.290，52.150 μg/ mL的系列對(duì)照品溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 8118.5X-3873.3（R2=1.0000，n=7）。結(jié)果表明，23-乙酰澤瀉醇B 質(zhì)量濃度在2.086～52.150 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：吸取溶液制備項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，按擬訂色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果23-乙酰澤瀉醇B峰面積的平均值為179743，RSD為0.72%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取溶液制備項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，16，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果23 - 乙酰澤瀉醇B 峰面積的平均值為181911，RSD為0.56%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為2005015）樣品，依法制備供試品溶液6 份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果23-乙酰澤瀉醇B 的平均含量為0.23 mg/g，RSD為0.63%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為2005015）適量，共9 份，精密稱定，置100 mL 錐形瓶中，分別加入23 - 乙酰澤瀉醇B對(duì)照品0.1669，0.2086，0.2503 mg，各3份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.41%，RSD為0.86%（n=9）。

4）樣品含量測(cè)定

取30批樣品各適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，各平行2份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中23-乙酰澤瀉醇B 的含量。結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，樣品中23-乙酰澤瀉醇B的含量為0.028～0.388 mg/g；H 生產(chǎn)企業(yè)的樣品含量為0.127～0.388 mg / g，批間含量差異較大；G 生產(chǎn)企業(yè)的樣品含量為0.143～0.162 mg/g，批間含量差異較小，均勻性較好；K生產(chǎn)企業(yè)的2 批樣品中的23-乙酰澤瀉醇B 的含量遠(yuǎn)低于其他生產(chǎn)企業(yè)的樣品，可能存在投料不足或原料藥質(zhì)量不佳的情況。本研究中僅有2批樣品，代表性不強(qiáng)，還需收集更多樣品進(jìn)行研究。

表2 樣品中23-乙酰澤瀉醇B含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.2 Results of content determination of 23 - acetyl alisol B in samples（mg/g，n=2）

2.2.3 電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法測(cè)定樣品中重金屬及有害元素含量

《中國(guó)藥典（四部）》［9］中方法，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測(cè)樣品中重金屬及有害元素Pb，As，Cd，Hg，Cu的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品中重金屬及有害元素含量測(cè)定結(jié)果（μg/g）Tab.3 Results of content determination of heavy metals and harmful elements in samples（μg/g）

參考2020年版《中國(guó)藥典（四部）》中植物類中藥材重金屬及有害元素限度規(guī)定，即Cu ≤20 mg/ kg，As ≤2 mg/kg，Cd ≤1 mg/kg，Pb ≤5 mg/kg，Hg ≤0.2 mg/kg。30 批樣品中，有2 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)Cu 超標(biāo)，有1 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)Hg 超標(biāo)。相較于中藥材，中成藥服用量及療程確切，故通過(guò)計(jì)算每周的重金屬攝入量，并與每周耐受攝入量（Pb=0.025 mg/kg，Cd=0.007 mg/kg，As=0.015 mg/kg，Hg=1.6 μg/kg，Cu=0.5 mg/kg）［10］進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)樣品的安全風(fēng)險(xiǎn)。公式為Xi'=Xi×I/W［10-11］，式中，Xi'為樣品中某種重金屬每千克體質(zhì)量的每周攝入量；Xi為樣品中某種重金屬含量；I為樣品的每周最大服用量；W為正常成年人的平均體質(zhì)量，取60 kg。樣品每日服用量取12 g，按上述公式計(jì)算，結(jié)果各重金屬及有害元素每周攝入量均低于每周耐受攝入量，表明風(fēng)險(xiǎn)較低，但長(zhǎng)期服用是否存在安全隱患尚需進(jìn)一步評(píng)估。

3 討論

3.1 含量測(cè)定指標(biāo)性成分選擇

澤瀉為方中臣藥，其藥理活性成分主要為澤瀉醇類［12-13］。其中，23-乙酰澤瀉醇B 為主要成分，故以澤瀉中的23 - 乙酰澤瀉醇B 為特征指標(biāo)，建立了考察龍膽瀉肝丸中澤瀉質(zhì)量的高效液相色譜法。

3.2 現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)存在的問(wèn)題

龍膽為方中君藥，清肝膽實(shí)火，清下焦?jié)駸幔稽S芩、梔子為臣藥，助龍膽清瀉肝火之功；澤瀉、木通、車前子清下焦?jié)駸?；地黃、當(dāng)歸為佐藥，補(bǔ)陰血；柴胡有疏肝之功效。本次抽檢樣品的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為2015年版《中國(guó)藥典（一部）》，其中僅對(duì)龍膽、梔子和黃芩進(jìn)行質(zhì)量控制，未控制其余藥味。故本研究中進(jìn)一步對(duì)澤瀉進(jìn)行探索性研究，建立了龍膽瀉肝丸（水丸）中澤瀉的含量測(cè)定方法。結(jié)合法定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及探索性研究發(fā)現(xiàn)，不同生產(chǎn)企業(yè)及相同生產(chǎn)企業(yè)不同批次間藥品的質(zhì)量存在一定差異，原因可能與生產(chǎn)工藝、投料量和原料藥質(zhì)量有關(guān)。建議生產(chǎn)企業(yè)落實(shí)主體責(zé)任，加強(qiáng)原料藥的質(zhì)量控制，保證產(chǎn)品質(zhì)量。

3.3 樣品中重金屬含量偏高

龍膽瀉肝丸（水丸）方中大部分藥材的藥用部位為根莖，故原料藥材的重金屬含量可能導(dǎo)致成藥中重金屬及有害元素含量偏高。通過(guò)探索性研究發(fā)現(xiàn)，30 批樣品中均不同程度檢出了Pb，As，Cu，Cd，Hg 元素，參考2020年版《中國(guó)藥典（四部）》中植物類中藥材重金屬及有害元素限度規(guī)定，樣品存在重金屬Hg和Cu含量超標(biāo)問(wèn)題。進(jìn)一步以各元素每周攝入量評(píng)價(jià)其風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果各元素每周攝入量均低于每周耐受攝入量，表明風(fēng)險(xiǎn)較低，但長(zhǎng)期服用是否存在安全隱患尚需進(jìn)一步評(píng)估。

3.4 建議

中藥材的質(zhì)量問(wèn)題與中成藥的重金屬污染情況密切相關(guān)，中藥材的重金屬污染是一個(gè)長(zhǎng)期且復(fù)雜的問(wèn)題，與中藥材產(chǎn)地、品種、入藥部位、生長(zhǎng)環(huán)境等諸多因素密切相關(guān)。建議藥品監(jiān)督管理部門增強(qiáng)對(duì)部分生產(chǎn)企業(yè)的監(jiān)管力度，持續(xù)強(qiáng)化日常監(jiān)督檢查與專項(xiàng)檢查工作，警示藥品生產(chǎn)企業(yè)加強(qiáng)對(duì)原料藥的質(zhì)量控制，消除安全隱患，從源頭控制藥品質(zhì)量，保障臨床用藥安全、有效。