冠心病患者血清miR-144和FOXF1表達(dá)及與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系

劉永俊 陳新榮 李永超 楊春

冠心病是冠脈粥樣硬化導(dǎo)致的冠脈管腔狹窄、阻塞，繼而引起相應(yīng)部位心肌缺血缺氧和壞死的心臟疾病[1]。微小核糖核酸(miRNA)是具有廣泛生物學(xué)調(diào)控作用的小分子非編碼RNA，在關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、脂蛋白代謝、內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和斑塊形成中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，與心血管疾病發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)[2]。miR-144在心肌細(xì)胞中有豐富表達(dá)，miR-144轉(zhuǎn)錄后可調(diào)節(jié)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP binding cassette transport protein A1，ABCA1)表達(dá)和血漿高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平，參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[3]。叉頭盒蛋白F1(fork head box protein F1，F(xiàn)OXF1)是一類(lèi)與胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)血管發(fā)育，調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，F(xiàn)OXF1表達(dá)異常與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)[4]。本研究檢測(cè)冠心病患者血清miR-144、FOXF1表達(dá)，分析其與冠狀動(dòng)脈病變的關(guān)系，以期為臨床病情監(jiān)測(cè)和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月至2020年3月我院收治的108例冠心病患者(冠心病組)，另選擇同期于我院門(mén)診體檢的100例年齡、性別相匹配志愿者為對(duì)照組，均行心電圖、超聲心動(dòng)圖、實(shí)驗(yàn)室檢查或CT心血管造影或冠狀動(dòng)脈造影排除冠心病。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有受試者及其家屬知情同意簽署同意書(shū)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《臨床冠心病診斷與治療指南》[5]；②年齡>18周歲；③均行冠脈造影檢查。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并甲狀腺癌、結(jié)腸癌、大腸癌等惡性腫瘤；②貧血、免疫系統(tǒng)疾病；③合并腦梗死。

1.3 血清miR-144與FOXF1檢測(cè) 冠心病組入院第2天(對(duì)照組體檢當(dāng)日)采集肘靜脈血3 ml平均注入干燥試管，干燥試管標(biāo)本經(jīng)離心(4℃，3 000 r/min，15 min，半徑10 cm)后取血清-80℃保存待檢。RT-PCR 檢測(cè)miR-144和FOXF1表達(dá)：TRIzol法提取總RNA，M-mlV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Epicentre 公司)將吸光度值A(chǔ)260/A280 RNA樣品轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)的CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR 儀檢測(cè)血清中miR-144、FOXF1表達(dá)，引物序列(由上海基康公司完成)：miR-144上游5’-ACACTCCAGCTGGGTACAGTATAGATGATG-3’。下游5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGTACATC-3’；FOXF1上游5’-CCTCGCACCTGGAGGCTGGCTG-3’，下游5’-TTATCAGTTGGGAAAATAGTA-3’。β-actin(內(nèi)參)上游：5’-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’，下游：5’-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3’。反應(yīng)條件：95℃變性10 s，65℃退火20 s; 75℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt計(jì)算miR-144和FOXF1相對(duì)表達(dá)量，共3次平行試驗(yàn)，取平均值。

1.4 冠狀動(dòng)脈造影 按照標(biāo)準(zhǔn)Judkins法[6]進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)，根據(jù)冠脈造影結(jié)果記錄累及冠脈支數(shù)，分為單支病變組(37例)、雙支病變組(48例)、多支病變組(三支及以上，23例)；冠脈狹窄程度，根據(jù)冠脈狹窄率(DS)分為[7]Ⅰ度～Ⅱ度組(80例，Ⅰ級(jí)狹窄：50.00%≤DS<70.00%，Ⅱ級(jí)狹窄：70.00%≤DS<90.00%)、Ⅲ度～Ⅳ度組(28例，Ⅲ級(jí)狹窄：90.00%≤DS≤99.00%，Ⅳ級(jí)狹窄：DS>99.00%)。SYNTAX積分計(jì)算方法主要是通過(guò)計(jì)算機(jī)程序得出，自網(wǎng)站www.syntaxscore.com計(jì)算SYNTAX積分。根據(jù)SYNTAX 積分評(píng)價(jià)冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度[8]并進(jìn)行分組：輕度組，SYNTAX 積分0～22分，共35例；中度組，SYNTAX積分23～32分，共44例；重度組，SYNTAX積分>32分，共29例。

2 結(jié)果

2.1 2組血清miR-144和FOXF1表達(dá)比較 冠心病組血清miR-144表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)OXF1表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組血清miR-144和FOXF1表達(dá)比較

2.2 2組基線資料比較 冠心病組體重指數(shù)(BMI)、冠心病家族史比例、合并高血壓比例、合并糖尿病比例、合并高血脂癥比例高于對(duì)照組(P<0.05)，2組年齡、性別比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組基線資料比較

2.3 不同冠脈病變程度患者血清miR-144和FOXF1表達(dá)比較 多支病變組血清miR-144表達(dá)高于雙支病變組和單支病變組(P<0.05)，F(xiàn)OXF1表達(dá)低于雙支病變組和單支病變組(P<0.05)。雙支病變組血清miR-144表達(dá)高于單支病變組(P<0.05)，F(xiàn)OXF1表達(dá)低于單支病變組(P<0.05)。重度冠脈病變組血清miR-144表達(dá)高于中度冠脈病變組和輕度冠脈病變組(P<0.05)，F(xiàn)OXF1表達(dá)低于中度冠脈病變組和輕度冠脈病變組(P<0.05)。中度冠脈病變組血清miR-144表達(dá)高于輕度冠脈病變組(P<0.05)，F(xiàn)OXF1表達(dá)低于輕度冠脈病變組(P<0.05)。Ⅲ度～Ⅳ度組血清miR-144表達(dá)高于Ⅰ度～Ⅱ度組(P<0.05)，F(xiàn)OXF1表達(dá)低于Ⅰ度～Ⅱ度組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同冠脈病變程度患者血清miR-144和FOXF1表達(dá)水平

2.4 相關(guān)性分析 miR-144表達(dá)與冠脈病變支數(shù)、冠脈狹窄率、SYNTAX積分呈正相關(guān)(P<0.05)，F(xiàn)OXF1表達(dá)與冠脈病變支數(shù)、冠脈狹窄率、SYNTAX積分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。miR-144表達(dá)與FOXF1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.927，P=0.000)。見(jiàn)表4。

表4 miR-144、FOXF1與冠脈病變支數(shù)、冠脈狹窄率、SYNTAX積分相關(guān)系數(shù)

2.5 miR-144、FOXF1診斷重度病變的價(jià)值分析 根據(jù)約登指數(shù)獲得miR-144、FOXF1診斷重度病變的最佳截?cái)嘀捣謩e為4.02、0.85，曲線下面積分別為0.698、0.658，聯(lián)合miR-144、FOXF1診斷重度病變的曲線下面積為0.932，高于單獨(dú)miR-144、FOXF1(Z=2.412、2.569，P=0.012、0.010)。見(jiàn)圖1，表5。

圖1 miR-144、FOXF1診斷重度病變的ROC圖

表5 miR-144、FOXF1診斷重度病變的效能分析

3 討論

冠心病是全球影響中老年人健康和生命安全的慢性疾病之一，隨著社會(huì)老齡化，冠心病住院率不斷增加[9]。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病發(fā)病基礎(chǔ)，脂質(zhì)代謝異常、炎性反應(yīng)、內(nèi)皮功能紊亂等貫穿動(dòng)脈粥樣硬化形成發(fā)展和破裂的整個(gè)過(guò)程[10]。miRNAs通過(guò)與靶mRNA的堿基對(duì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡，炎性反應(yīng)，脂質(zhì)代謝，血小板功能等參與動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病發(fā)病過(guò)程[11,12]。因此探討與冠心病相關(guān)的miRNAs有助于了解病情，為臨床治療提供新的靶點(diǎn)和方向。

miR-144定位于人類(lèi)染色體17q11.2區(qū)域，在淋巴瘤、白血病、胃癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，并通過(guò)不同靶基因發(fā)揮致癌基因或抑癌基因作用，參與腫瘤增殖，凋亡，遷移和轉(zhuǎn)移過(guò)程[13]。miR-144-3p還可靶向環(huán)氧合酶2參與子癇前期的發(fā)病機(jī)制[14]。miR-144在心血管疾病的報(bào)道筆者所見(jiàn)并不多見(jiàn)，本研究發(fā)現(xiàn)冠心組血清miR-144表達(dá)高于對(duì)照組，且多支病變組、冠脈狹窄Ⅲ度～Ⅳ度組、重度冠脈病變組血清miR-144表達(dá)高于單支/雙支病變組、冠脈狹窄Ⅰ度～Ⅱ度組和輕/中度冠脈病變組，說(shuō)明miR-144不僅與冠心病發(fā)病有關(guān)，而且與冠心病患者冠脈病變程度有關(guān)。分析miR-144參與冠心病發(fā)病和冠脈病變進(jìn)展的機(jī)制：(1)miR-144具有調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)和炎性反應(yīng)作用，miR-144過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)炎性因子白介素-1β，白介素-6和腫瘤壞死因子-α的表達(dá)，抑制了巨噬細(xì)胞衍生的泡沫細(xì)胞中膽固醇外流，降低HDL-C水平，進(jìn)而加速動(dòng)脈粥樣硬化的病理進(jìn)展[15]。miR-144調(diào)控膽固醇穩(wěn)態(tài)和炎性反應(yīng)可能通過(guò)靶向ABCA1實(shí)現(xiàn)[16]。(2)miR-144具有調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖和凋亡作用，miR-144通過(guò)直接靶向TBX1激活Janus酪氨酸激酶2(JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子1(STAT1)途徑，miR-144過(guò)表達(dá)通過(guò)TBX1/JAK2/STAT1途徑促使心肌細(xì)胞凋亡[17]。心肌細(xì)胞凋亡與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，在心肌缺血缺氧、缺血再灌注損傷、急性心肌梗死時(shí)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死和凋亡[18]，發(fā)生不可逆心肌損傷。由此可見(jiàn)miR-144還可調(diào)控心肌細(xì)胞增殖和凋亡參與冠心病發(fā)病和進(jìn)展。

FOXF1是叉頭盒蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，在胚胎、食管、氣管、肺等多組織中廣泛表達(dá)，參與血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖生長(zhǎng)和VEGF信號(hào)傳導(dǎo)，在維持脈管系統(tǒng)穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用[19]。有研究顯示FOXF1基因突變可抑制血管生成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)轉(zhuǎn)錄，抑制肺泡毛細(xì)血管生成[20]。FOXF1還可通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活SNAI1誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促使結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。FOXF1是否參與冠心病發(fā)病機(jī)制尚不清楚，本研究結(jié)果表明冠心病組血清FOXF1表達(dá)明顯低于對(duì)照組，F(xiàn)OXF1表達(dá)于冠脈病變支數(shù)、冠脈狹窄率、SYNTAX積分呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明FOXF1表達(dá)缺失可導(dǎo)致冠脈病變的發(fā)生，冠脈病變范圍的擴(kuò)大和程度的加重。分析原因，F(xiàn)OXF1在內(nèi)皮集落形成細(xì)胞選擇性表達(dá)，F(xiàn)OXF1過(guò)表達(dá)可特異性誘導(dǎo)Notch2受體表達(dá)促使內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和新生血管形成[22]，F(xiàn)OXF1表達(dá)缺乏則不利于冠脈阻塞后新生血管和側(cè)支循環(huán)的形成，進(jìn)一步加重心肌缺血缺氧甚至壞死，導(dǎo)致嚴(yán)重的冠脈病變結(jié)果。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果表明，miR-144表達(dá)與FOXF1呈負(fù)相關(guān)，提示在冠脈病變過(guò)程中miR-144與FOXF1可能存在相互抑制作用機(jī)制。Liu等[22]報(bào)道指出FOXF1為miR-144的靶基因，miR-144可與FOXF1靶向結(jié)合并抑制FOXF1的表達(dá)，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡。ROC分析聯(lián)合miR-144、FOXF1可用于鑒別重度冠脈病變和輕中度冠脈病變，可為臨床識(shí)別高風(fēng)險(xiǎn)人群提供參考。

綜上所述，冠心病患者血清miR-144表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)OXF1表達(dá)下調(diào)，miR-144過(guò)表達(dá)、FOXF1表達(dá)缺乏均與冠脈病變程度加重，范圍擴(kuò)大有關(guān)。在冠脈病變過(guò)程中，miR-144可能通過(guò)抑制FOXF1表達(dá)導(dǎo)致和加重冠脈病變，兩者在冠脈病變程度評(píng)估中有較高應(yīng)用價(jià)值。