黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在黑曲霉中的同源表達

趙書范，李琪，聶紅梅，汪釗，鄭建永

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州，310032)

脂肪酶(EC 3.1.1.3,lipase)又稱為三酰基甘油水解酶，是一類重要的水解酶，可催化酯水解、酯化和酯交換等反應[1-3]。脂肪酶普遍存在于自然界中，在植物、動物和微生物中均有發現[4]。目前脂肪酶的工業化生產主要利用微生物發酵[5-6]。脂肪酶在兩相界面、水性介質或有機相體系中均能進行催化反應，是工業生產應用的關鍵酶，在生物柴油、食品、化妝品、皮革、紡織、洗滌業和制藥等領域具有良好的應用前景[7-8]。

黑曲霉作為外源蛋白表達宿主，具有優異的蛋白分泌能力、準確的翻譯后加工能力以及出色的遺傳穩定性，同時具有良好的安全性。黑曲霉表達系統在表達重組蛋白領域具有巨大潛力，逐漸成為蛋白工廠[9-10]。黑曲霉脂肪酶多為胞外酶，因此不僅可以利用液體培養基進行發酵，還能采用低成本的固體培養基進行生產。朱思遠[11]通過轉錄和轉錄后水平改造提高了黑曲霉脂肪酶的表達量，開展了CRISPR/Cas9技術在黑曲霉表達系統中的應用，構建了尿嘧啶缺陷型菌株。但是近年來對于微生物資源的開發利用率相對較低，僅在1%左右[12]。脂肪酶在工業化生產中也面臨著生產效率不高的問題，因此探索提高脂肪酶產量和活力的方法是當前研究的熱點[13-14]。

本研究利用生物學信息庫進行信息分析和對比，對黑曲霉基因組中的脂肪酶功能基因進行挖掘和篩選。利用原生質體-PEG轉化法構建黑曲霉工程菌，實現8種黑曲霉來源脂肪酶基因的同源表達。通過對表達質粒啟動子和信號肽的優化以提高蛋白表達水平，并對重組脂肪酶進行純化和酶學性質表征。

1 材料與方法

1.1 菌種與質粒

黑曲霉(Aspergillusniger)AS3.350、E.coliDH5α、E.coliRosetta(DE3)、黑曲霉MA、質粒pCAMBIA和質粒pET-28a(+)均為本實驗室保存。

1.2 材料與試劑

DNA聚合酶、限制性內切酶、DNA凝膠回收試劑盒，寶日醫(北京)生物技術有限公司；質粒小提試劑盒、片段純化試劑盒和RNA提取試劑盒，北京全式金生物有限公司；一步克隆連接試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 黑曲霉脂肪酶基因的生物信息分析

從NCBI數據庫中查找黑曲霉來源脂肪酶并比對分析后，選取了8個黑曲霉脂肪酶，目的基因詳情見表1。利用在線工具MAFFT對這8個脂肪酶的編碼序列進行多序列比對，利用在線工具SignalP4.1對這8個脂肪酶進行信號肽預測等生物信息學分析。

表1 脂肪酶基因來源和氨基酸信息Table 1 The sources of lipase gene and amino acid information

1.4 黑曲霉脂肪酶基因克隆與表達

黑曲霉AS3.350總RNA的提取、cDNA的制備與純化按照試劑盒說明書進行，質粒和PCR產物酶切、連接、熱激法轉化、原生質體-PEG轉化法及轉化子篩選等均采用實驗室常規方法進行[15]。

1.5 黑曲霉工程菌轉化質粒的優化

1.5.1 含不同信號肽質粒的構建

分別設計引物pCAMBIA-F和pCAMBIA-ScbhΙ-R；pCAMBIA-F和pCAMBIA-SANL-R以pCAMBIA-PgpdA-SglaA-H3為模板擴增。將含有不同信號肽的目的基因與載體連接構建pCAMBIA-PglaA-ScbhΙ-H3和pCAMBIA-PglaA-SANL-H3重組質粒。將不同質粒轉入黑曲霉宿主，通過對酶活力的測定和SDS-PAGE分析，選擇最優的黑曲霉系統表達信號肽。

1.5.2 含不同啟動子質粒的構建

設計引物pCAMBIA-PglaA-F和pCAMBIA-PglaA-R以pCAMBIA-PgpdA-SglaA-H3為模板擴增。將PglaA啟動子與載體連接構建pCAMBIA-PglaA-SglaA-H3重組質粒并轉入黑曲霉宿主，通過酶活力的測定和SDS-PAGE分析，選擇最優的黑曲霉系統表達啟動子。

1.6 黑曲霉工程菌的活化與發酵培養

將4 ℃保藏的菌種劃線到潮霉素B抗性質量濃度為200 μg/mL的PDA平板上，30 ℃培養4 d，用無菌水沖洗孢子做成孢子懸液，充分振蕩30 min。按0.8%的接種量接入到75 mL液體發酵培養基中，30 ℃、150 r/min搖床培養6 d。發酵培養基(g/L)：玉米淀粉50，玉米漿30，豆粕粉20。

1.7 黑曲霉脂肪酶的分離與純化

收集發酵培養后的發酵液，用300目的過濾篩濾去菌絲體，將粗酶液于10 000 r/min離心10 min，保留上清液，再用0.22 μm的微濾膜進行微濾。將粗酶液用鎳柱親和層析樹脂純化，收集純化的酶液，透析去除高濃度咪唑獲得純化后的酶溶液。

1.8 脂肪酶的酶活力測定方法

利用對硝基苯酚乙酸酯(pNPA)作為底物進行脂肪酶酶活力的檢測。脂肪酶能夠水解pNPA產生對硝基苯酚(p-NP)。在pH 7.0，40 ℃條件下，1 min釋放1 μmol的p-NP為1個酶活力單位。

1.9 黑曲霉脂肪酶的酶學性質表征

1.9.1 酶最適溫度及溫度穩定性

在不同溫度(25～60 ℃)下，通過測定脂肪酶ANL-H3催化pNPA的水解活性來確定酶的最適反應溫度。將最適溫度條件下的酶活力定義為100%。將酶溶液分別放置于不同溫度(25～60 ℃)下孵育2 h，每隔20 min取樣檢測酶液的水解活性，觀察ANL-H3的熱穩定性。將放置0 h酶液的酶活力定義為100%。

1.9.2 酶最適反應pH及pH穩定性

在不同pH值(pH 5.0～9.0)下，使用pNPA作為底物測定脂肪酶ANL-H3的水解活性來確定酶的最適pH。在4 ℃條件下，將酶液分別置于(pH 5.0～9.0)的緩沖溶液中2 h，每隔20 min取樣測定酶液的水解活性，觀察ANL-H3的pH穩定性。將放置0 h的酶液的酶活力定義為100%。各pH緩沖體系分別為：50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 5.0～5.5)；50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.0～8.0)；50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.5～9.0)。

1.9.3 酶的催化底物特異性

以不同碳鏈長度脂肪酸(C2～C16)的對硝基苯酚酯為底物，在40 ℃，pH 7.0的條件下測水解活性。將最高酶活力定義為100%。

1.9.4 金屬離子對酶活性的影響

在酶溶液中分別加入終濃度為1和5 mmol/L的金屬離子(Na+、Mn2+、Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+和Zn2+)，在4 ℃放置1.5 h，隨后測定脂肪酶ANL-H3催化pNPA的酶活力，以未添加金屬離子處理的酶液作為對照組。計算相對酶活力，將對照組的酶活力定義為100%。

1.9.5 有機溶劑對酶活性的影響

在標準反應體系中分別加入5%、10%的有機溶劑(甲醇、乙腈、丙酮、DMF、DMSO和四氫呋喃)，在4 ℃放置1.5 h，測定脂肪酶ANL-H3催化pNPA的酶活力，以不加有機溶劑的酶液作為對照組。計算相對酶活力，將對照組的酶活力定義為100%。

1.10 黑曲霉脂肪酶的動力學參數測定

在最佳測定條件下，計算黑曲霉脂肪酶ANL-H3在不同pNPA濃度下(1～100 mmol/L)的反應初速度。利用軟件Origin 8.5非線性擬合(參考Michaelis-Menten方程)得到米氏常數Km和最大反應速率Vmax。

2 結果與討論

2.1 黑曲霉脂肪酶基因的克隆及工程菌的構建

利用生物學信息庫信息分析和全基因組檢索發現結構和功能與已知酶類似的同源酶編碼序列和一些未探究的編碼片段，對黑曲霉全基因組中脂肪酶功能基因進行挖掘篩選，選取了8個來源于黑曲霉，分子質量為20～40 kDa的黑曲霉脂肪酶基因。以黑曲霉AS3.350的cDNA為模板，對該8個基因進行PCR擴增，并命名為H1～H8。重組質粒pCAMBIA-H1(-8)轉化在黑曲霉MA中，獲得H1(-8)重組黑曲霉工程菌，命名為MA-H1(-8)。

2.2 高活力黑曲霉脂肪酶工程菌的篩選

檢測8個黑曲霉工程菌MA-H1(-8)發酵10 d的上清液的脂肪酶活力，結果如圖1所示。轉化子MA-H2和MA-H3的酶活力較高，最高酶活力分別為1.37和1.41 U/mL。分別取重組脂肪酶轉化子酶活力最高的發酵上清液進行SDS-PAGE分析，MA-H2、MA-H3的酶活力最高，相應泳道中目的蛋白條帶也較粗，說明了這2個重組黑曲霉菌株有較高的蛋白表達量，考慮到最高酶活力以及發酵周期長短等因素，最終選擇黑曲霉脂肪酶ANL-H3基因作為目標脂肪酶基因進行后續的優化研究。

圖1 黑曲霉工程菌發酵上清液的酶活力情況Fig.1 Enzyme activity in fermentation supernatant of A. niger engineering strain

2.3 黑曲霉脂肪酶基因信號肽和啟動子的優化

信號肽對蛋白質的外源表達具有非常關鍵的影響，信號肽連接目的蛋白形成1個蛋白嵌合體，最終的分泌效率受到其構型、表面電荷分布和分子質量等因素的影響[16]。擴增帶有cbhΙ信號肽和ANL信號肽的目的基因，構建pCAMBIA-PglaA-ScbhΙ-H3和pCAMBIA-PglaA-SANL-H3重組質粒，將質粒片段轉入黑曲霉宿主。經酶活力測定，以glaA、cbhΙ和ANL為信號肽的脂肪酶活力分別為1.41、1.12和0.57 U/mL。因此選擇glaA為最優的黑曲霉系統表達信號肽。

以黑曲霉cDNA為模板擴增PglaA啟動子，構建pCAMBIA-PglaA-SglaA-H3重組質粒。將質粒片段轉入黑曲霉宿主，以PglaA為啟動子的重組工程菌的蛋白表達量更高，而且其脂肪酶酶活力為1.68 U/mL，比以PgpdA為啟動子的重組菌的酶活力高，因此選擇PglaA為最優的黑曲霉系統表達啟動子。通過插入基因的修飾以提高黑曲霉脂肪酶表達量的優化實驗，最終選擇pCAMBIA-PglaA-SglaA-H3重組質粒進行后續實驗研究。

2.4 黑曲霉脂肪酶的分離與純化

利用鎳離子親和層析柱純化酶蛋白，洗脫下來的蛋白溶液經超濾管(10 kDa)超濾除鹽和濃縮，純化后脂肪酶的比活力達31.44 U/mg，純化倍數為65.5倍，但酶活力的回收率較低，僅為7.84%。

2.5 黑曲霉脂肪酶的酶學性質

2.5.1 酶最適溫度和溫度穩定性

在不同的溫度下，ANL-H3的酶活力變化結果如圖2所示。在25～45 ℃，ANL-H3活性隨著溫度升高逐漸增加，ANL-H3的最適溫度是45 ℃。當溫度進一步升高，酶活力顯著下降。

圖2 溫度對黑曲霉脂肪酶ANL-H3活性的影響Fig.2 Effects of temperature on the activity of ANL-H3

進一步測定了ANL-H3在不同溫度條件下保持2 h酶殘留的活力，以考察其熱穩定性，結果如圖3所示。在25～40 ℃下，ANL-H3酶活力基本保持不變；在45～55 ℃下的仍可以保持80%以上的酶活力，當酶蛋白在60 ℃處理2 h，酶活力開始下降，維持在初始活力的60%左右，說明ANL-H3擁有良好的熱穩定性。在實際應用中，結合最適溫度與溫度穩定性這2個因素，選擇45 ℃為最適反應溫度。

圖3 黑曲霉脂肪酶ANL-H3的溫度穩定性Fig.3 The thermal stability of ANL-H3

2.5.2 酶最適pH和pH穩定性

考察不同pH條件下脂肪酶ANL-H3的水解活性，結果如圖4所示，ANL-H3的最適pH為7.5，在pH 7.0～8.0都具有較高的活性，酶活力保持在85%以上。隨著pH的進一步下降或升高，酶活力均明顯下降，表明ANL-H3的最適pH范圍為中性條件。

圖4 pH對黑曲霉脂肪酶ANL-H3活性的影響Fig.4 Effects of pH on the activity of ANL-H3

將該酶在4 ℃，不同pH條件下處理2 h，結果如圖5所示，ANL-H3在最適pH下最為穩定，酶活力保持在95%以上；在pH 6.0～8.0，ANL-H3的酶活力均保持在75%以上，具有良好的穩定性。在pH酸性或者強堿性條件下處理2 h，酶殘留活力下降至55%左右，結果表明該酶是一種pH中性酶。

圖5 黑曲霉脂肪酶ANL-H3的pH穩定性Fig.5 The pH stability of ANL-H3

2.5.3 酶的催化底物特異性

分別以不同碳鏈長度脂肪酸(C2～C16)的對硝基苯酚酯為催化底物，探究脂肪酶ANL-H3的底物特異性。由圖6可知，ANL-H3對不同碳鏈長度底物的水解活性不同，其中對pNPA的催化活性最高，具有較廣的底物特異性，對不同碳鏈長度脂肪酸酯的底物都有良好的催化活性。

圖6 黑曲霉脂肪酶ANL-H3對p-NP酯的底物特異性Fig.6 Substrate specificity of ANL-H3 towards pNP esters

2.5.4 金屬離子對酶活力的影響

金屬離子是影響酶催化性能的重要參數之一[17]。金屬離子可以通過與酶的二硫鍵作用，從而改變酶的結構。考察不同金屬離子對ANL-H3的影響，實驗結果如圖7所示。結果表明在離子濃度較低(1 mmol/L)時，金屬離子對脂肪酶的抑制作用不明顯，其中Mg2+、K+等有激活作用；當離子濃度為5 mmol/L時，Mn2+、Cu2+完全抑制脂肪酶的活性，酶活力只有對照組的10%左右。Mg2+、K+等金屬離子對ANL-H3有較明顯的激活作用，可分別提高20%～30%左右的酶活力。

圖7 金屬離子對黑曲霉脂肪酶ANL-H3活性的影響Fig.7 Effects of metal ions on the activity of ANL-H3

2.5.5 有機溶劑對酶活力的影響

酶催化反應可在非水相介質中進行，由于有機溶劑等非水相介質對催化體系pH值、離子濃度及極性等性質的改變，使得酶蛋白分子在非水相介質中容易失去催化活性[18-19]。在酶催化反應體系中分別加入5%和10%的有機溶劑，以不加有機溶劑作為對照組。由圖8可知，甲醇和DMSO對ANL-H3酶活力有一定的促進作用，在甲醇和DMSO質量分數為10%時，酶活力分別為對照組126.5%和116.23%，其余4種溶劑對ANL-H3有不同程度的抑制作用。

圖8 有機溶劑對黑曲霉脂肪酶ANL-H3活性的影響Fig.8 Effects of organic solvents on the activity of ANL-H3

2.6 黑曲霉脂肪酶的動力學參數

以pNPA為底物，在0.1～3.0 mmol/L濃度下測定脂肪酶ANL-H3的動力學參數，所得結果如圖9所示。根據實驗數據計算，通過Origin 8.5擬合獲得的米氏常數Km為1.893 mmol/L，最大反應速度Vmax為1.610 mmol/(L·min)，催化常數kcat為90.45 min-1，催化效率kcat/Km為47.78 L/(min·mmol)，kcat/Km被認為能最全面的衡量酶催化能力的指標，數值越大催化效率越高。ANL-H3的Km值低表明其對底物pNPA的親和力高，酶促反應易于進行[20]，且ANL-H3的Kcat/Km值較高，表明酶的催化效率較高。

圖9 黑曲霉脂肪酶ANL-H3以pNPA為底物的米氏方程圖Fig.9 Michaelis-Menten equation diagram of ANL-H3 using pNPA as substrate

3 結論

本研究以1株低蛋白背景的黑曲霉MA作為表達宿主，構建以潮霉素B抗性為篩選標記的重組表達質粒，實現8種不同黑曲霉脂肪酶基因在黑曲霉中的同源表達，確定表達最好的轉化子MA-H3-PglaA-SglaA。經重組表達與分離純化后，該重組酶的比酶活力為31.44 U/mg，純化倍數為65.5倍，酶純化的回收率為7.84%。在以pNPA為底物時，酶的最適溫度為45 ℃，最適pH為7.5。ANL-H3對pNPA(C2)的水解活力最高，傾向于中短鏈脂肪酸的底物。在高濃度的金屬離子條件下，Mn2+、Cu2+使ANL-H3基本失活，K+、Mg2+等金屬離子對ANL-H3有較明顯的激活作用。ANL-H3對甲醇和DMSO有較好的有機溶劑耐受性。ANL-H3的米氏常數Km為1.893 mmol/L，Vmax為1.610 mmol/(L·min)，kcat為90.45 min-1，催化效率kcat/Km為47.78 L/(min·mmol)。