益生菌發酵藍莓的體外抗氧化活性分析

楊琦，謝純良，周映君，龔文兵，朱作華，許超，彭源德

(中國農業科學院麻類研究所，湖南 長沙，410205)

藍莓富含花青素、多酚類等多種活性成分，具有高效清除氧自由基的作用，是一種營養價值豐富的漿果[1]。近年來，我國的藍莓產業發展迅速，藍莓栽培面積和產量均顯著增加，開發前景巨大，經濟效益可觀。目前，應季鮮果是藍莓的主要消費途徑，然而，藍莓鮮果采摘后感染腐敗微生物的幾率大，不易長久保存，這對于拓展藍莓消費市場極為不利。鮮果精深加工是有效延長藍莓產品保藏期的重要手段，可延伸藍莓的產業鏈，賦予藍莓更高的經濟價值。

微生物發酵技術在鮮果加工產業中應用廣泛，該技術的蓬勃發展使其迅速成為藍莓精深加工的研究熱點[2]。在市場上常見的微生物發酵加工制成的藍莓產品有果醋、果酒、酵素、果汁等，這些產品能在蘊含藍莓自然芳香的基礎上，通過微生物發酵保留大部分營養成分或轉化形成新的活性物質[3]。益生菌是通過定殖在人體內，改變宿主某一部位菌群組成，對宿主有益的一類活性微生物，應用最廣泛的益生菌有乳酸菌和酵母菌等[4]。目前，益生菌在市場上主要以發酵乳制品的形式出售，如酸奶等[5]。然而，乳制品中存在致敏原，導致部分消費者無法放心食用，因此，近年來越來越多的研究者開展了益生菌發酵非乳制品的相關研究[6-7]。果蔬汁具有蛋白質、礦物質、糖、脂肪、維生素等多種營養成分，是開發非乳制品益生菌飲料的理想基質[7-8]。目前，利用益生菌加工藍莓多見于乳酸菌與酵母菌的發酵[9]，或者是藍莓的自然發酵[10]，而乳酸菌與酵母菌復合發酵可進一步提高發酵產品的抗氧化等性能[11-12]。以藍莓鮮果為原料，經益生菌發酵加工而成的發酵飲品，是拓展藍莓產業的新方向。

因此，本文利用實驗室優質益生菌(植物乳桿菌Picp-2和單胞釀酒酵母菌ZLG-6)對藍莓鮮果進行單一和復合菌種發酵，以藍莓鮮果發酵液的抗氧化活性、酚類物質含量和產品感官評分為標準對不同發酵方式進行評估。旨在開發高抗氧化活性的藍莓發酵飲品，提高藍莓鮮果的附加值，豐富藍莓飲品的種類。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮藍莓果榨汁(品種為“兔眼”)；乳酸菌：植物乳桿菌Picp-2(菌種保藏號：M20191045，保藏于中國典型培養物保藏中心)；酵母菌：單胞釀酒酵母菌ZLG-6(菌種保藏號：M20191046，保藏于中國典型培養物保藏中心)；MRS培養基，杭州百思生物技術有限公司；YPD培養基：酵母提取物1%、葡萄糖2%和大豆蛋白胨2%。

1.2 實驗方法

將乳酸菌與酵母菌分別在MRS和YPD培養基中活化，當OD600值達到(0.5±0.05)時，可用于發酵藍莓鮮果。

取藍莓鮮果榨汁，按照200 mL每瓶分裝于250 mL的藍蓋瓶中，75 ℃條件下處理30 min。按相應接種量加入已活化的乳酸菌或酵母菌，混勻，置于培養箱中發酵。

1.2.1 自然發酵

在30 ℃下進行發酵。

1.2.2 單一菌種發酵

植物乳桿菌Picp-2接種量10%，在37 ℃下發酵；單胞釀酒酵母菌ZLG-6的接種量1%，在30 ℃下發酵。

1.2.3 復合菌種發酵

先接入植物乳桿菌Picp-2發酵3 d(接種量10%，培養溫度37 ℃)，再接入單胞釀酒酵母菌ZLG-6繼續發酵10 d(接種量1%，培養溫度30 ℃)。

1.2.4 評價與分析

發酵周期13 d，發酵結束得藍莓發酵飲品。將藍莓發酵飲品離心，測定抗氧化活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力和酚類物質含量。

1.3 實驗方法

1.3.1 體外抗氧化能力的檢測

1.3.1.1 DPPH自由基清除率的測定[13]

在1 mL待測樣品中加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻靜置30 min，517 nm波長處測吸光值。每個樣品設置3個平行。用蒸餾水將待測樣品稀釋成不同的濃度，測定不同濃度樣品的DPPH自由基清除能力，通過Origin軟件擬合，計算IC50值。IC50值定義為當清除率為50%時，1 mL待測樣品中所含藍莓發酵飲品原液的體積(mL/mL)，所需濃度越低，表明該物質抗氧化性越強。DPPH自由基清除率A1計算如公式(1)所示：

(1)

式中：As，1 mL待測樣品加1 mL DPPH乙醇溶液的吸光值；Ax，1 mL樣品加1 mL溶劑的吸光值；A0，1 mL DPPH乙醇溶液加1 mL溶劑的吸光值。

1.3.1.2 ·OH清除率的測定[14]

采用Fenton反應法，反應體系中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L H2O2溶液、待測樣品或蒸餾水(對照)各2 mL，靜置10 min后加入2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液，靜置30 min，測定510 nm波長下的吸光值。參考1.3.1.1的方法計算IC50值。·OH清除率A2計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A0，待測樣品的吸光值；Ax，蒸餾水(對照)的吸光值。

1.3.1.3 ABTS陽離子自由基清除率的測定[15]

各取0.2 mL 7.4 mmoL/L ABTS與2.6 mmoL/L K2S2O8溶液，混勻后暗處反應12 h，再用95%乙醇稀釋40～50倍，使該混合液(工作液)在734 nm波長下的吸光值處于0.68～0.72。將0.8 mL工作液與0.2 mL待測樣品或95%乙醇(對照)混勻，靜置6～8 min，測定734 nm波長下的吸光值。參考1.3.1.1的方法計算IC50值。ABTS陽離子自由基清除率A3計算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0,待測樣品的吸光值；Ax，95%乙醇(對照)的吸光值。

1.3.2 總多酚含量測定[16]

以沒食子酸作為標準品，采用福林-西奧卡特法測定總多酚含量。將0.1 mL待測樣品與0.05 mL Folin-Ciocalteu試劑混合，反應3～8 min后加入0.15 mL質量濃度200 g/L的Na2CO3溶液，反應60 min后，在765 nm波長處測量吸光值，以沒食子酸為標準品制作總多酚含量的標準曲線，根據標準曲線計算總多酚含量，總多酚的含量以沒食子酸(g/L)表示。

1.3.3 SOD活力檢測

SOD活力用WST-1法檢測，參考試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 感官評分評價方法

征求25名志愿者品嘗藍莓鮮果發酵飲品，從色澤、口味、氣味與體驗感4個方面進行獨立打分，總分10分，評分細則參照表1。

表1 藍莓鮮果發酵飲品評分細則Table 1 Detailed grading rule for probiotics fermented blueberry drinks

2 結果與分析

2.1 不同發酵方式對體外抗氧化活性的影響

氧化損傷是人體衰老的主要原因，還可引起高血脂、糖尿病及心腦血管疾病等。果蔬經益生菌發酵后，其制品的抗氧化能力顯著增強，因為益生菌在發酵過程中可水解一些結合酚，釋放游離酚，提高生物利用率，從而提高抗氧化能力[18]。藍莓中富含的花青素、多酚類物質，具有很強的抗氧化性。圖1為不同發酵方式發酵飲品的抗氧化能力，圖2為相應IC50。

圖1 發酵方式對藍莓鮮果發酵飲品抗氧化能力的影響Fig.1 Effects of fermentation methods on antioxidant capacity of fermented blueberry drinks

如圖1所示，藍莓鮮果發酵飲品的DPPH自由基清除率在自然發酵、乳酸菌、酵母菌與復合發酵的條件下，分別為96.65%、98.4%、97.67%和96.76%，其DPPH自由基清除率的IC50值分別為(0.78±0.05)、(0.52±0.06)、(0.56±0.06)和(0.42±0.04)mL/mL(圖2)，說明經由復合發酵所獲得的藍莓發酵飲品，其DPPH自由基的清除能力最強。藍莓鮮果發酵飲品的·OH清除率在自然發酵、乳酸菌、酵母菌與復合發酵的條件下，分別為80.97%、85.69%、86.36%和85.3%(圖1)，經計算，·OH清除率的IC50值分別為(0.62±0.06)、(0.53±0.04)、(0.52±0.03)和(0.54±0.02)mL/mL(圖2)，說明經益生菌發酵后，其·OH清除率相較于自然發酵狀態更高，但·OH的清除率在單一菌株發酵和復合發酵的條件下，未見明顯差異。藍莓鮮果發酵飲品的ABTS陽離子自由基清除率在自然發酵、乳酸菌、酵母菌與復合發酵的條件下，分別為80.64%、86.64%、90.32%和91.76%，其ABTS陽離子自由基清除率的IC50值分別為(0.69±0.02)、(0.58±0.03)、(0.46±0.02)和(0.41±0.03)mL/mL，說明相較于自然發酵，添加益生菌有助于提高藍莓鮮果發酵飲品的ABTS陽離子自由基清除率，且復合菌種發酵的效果優于單一菌種發酵。

發酵體系的穩定性是考量藍莓鮮果發酵飲品品質是否穩定的重要因素[19]。從圖1可知，乳酸菌或酵母菌這類經由單一菌種發酵的體系，其穩定性顯著優于自然發酵或復合發酵的體系。說明在發酵體系中添加益生菌使其成為優勢菌種，更有利于發酵系統的穩定性；復合發酵體系的穩定性低于單一菌種發酵，推測發酵體系中菌種的種類越復雜，其穩定性控制的難度越高。

圖2 不同發酵方式下藍莓鮮果發酵飲品清除 自由基的IC50值Fig.2 IC50 values of free radical scavenging rates of fermented blueberry drinks using different fermentation methods

2.2 不同發酵方式對SOD活力的影響

SOD是機體內能夠清除超氧陰離子自由基的預防型抗氧化劑，可用于衡量機體抗氧化能力強弱[20]。藍莓鮮果發酵飲品在自然發酵、乳酸菌、酵母菌與復合發酵的條件下，其SOD活力分別為255.23、296.31、261.04、300.93 U/mL(圖3)。結果表明，益生菌的發酵過程可促進藍莓鮮果發酵飲品SOD活力的增加，尤其是乳酸菌的添加可顯著提高發酵體系中SOD活力水平[21]。

圖3 發酵方式對藍莓鮮果發酵飲品SOD活力的影響Fig.3 Effects of fermentation methods on SOD activity of fermented blueberry drinks

2.3 不同發酵方式對總多酚含量的影響

植物多酚具有抗癌、抗衰老、預防心腦血管疾病、抗氧化等多種生物活性，在延緩衰老、增強免疫力、保護視力、改善弱視、抗氧化、保護人體免受自由基的損傷等方面效果顯著[22]。從圖4可知，藍莓鮮果發酵飲品在自然發酵、乳酸菌、酵母菌與復合發酵的條件下，其總多酚含量分別為6.82、6.16、6.84、7.07 g/L，與自然發酵相比，乳酸菌發酵的體系中其總多酚含量顯著降低，酵母菌發酵的體系未見明顯差異，但復合發酵體系中的總多酚含量高于自然發酵，推測藍莓鮮果在乳酸菌與酵母菌的協同作用下，可提高該發酵飲品中的總多酚含量。

圖4 發酵方式對藍莓鮮果發酵飲品總多酚含量的影響Fig.4 Effects of fermentation methods on the content of total polyphenols in fermented blueberry drinks

2.4 不同發酵方式對感官評價的影響

由圖5可知，藍莓鮮果發酵飲品在自然發酵、乳酸菌、酵母菌與復合發酵的條件下，其感官評分分別為4.68、8.66、8.35和8.98，說明在藍莓鮮果發酵過程中添加益生菌，可有效地提高發酵飲品的感官評價，尤其是乳酸菌發酵過程中可產生大量的風味物質，可賦予發酵飲品更怡人的感官享受。

圖5 發酵方式對藍莓鮮果發酵飲品感官評價的影響Fig.5 Effects of fermentation methods on sensory evaluation of fermented blueberry drinks

3 結論

以榨汁的藍莓鮮果為原料，利用本研究室篩選的植物乳桿菌Picp-2和單胞釀酒酵母菌ZLG-6制備藍莓鮮果發酵飲品，通過比較飲品的抗氧化性能、SOD活力、總多酚含量和感官評價，發現復合發酵的方式優于自然發酵和單一菌種發酵，是最適于加工藍莓鮮果發酵飲品的工藝。該工藝條件下，藍莓鮮果發酵飲品的DPPH自由基清除率為96.76%(IC50值為0.42 mL/mL)、·OH清除率為85.30%(IC50值為0.54 mL/mL)、ABTS陽離子自由基清除率為91.76%(IC50值為0.41 mL/mL)、SOD活力為300.93 U/mL、總多酚含量為7.07 g/L、感官評分為8.98。本研究確定了藍莓鮮果發酵飲品的最佳發酵方式，獲得了一款具有高抗氧化性能的富營養藍莓飲品，為深入研究藍莓鮮果發酵飲品的制備工藝奠定了理論和數據基礎。