洋蔥皮提取物對卡拉膠可食性膜的物化性質及生物活性的影響

王存堂，李子鈺，高增明，張福娟，孫敬明，王璇

1(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)2(朝陽師范高等專科學校 生化工程系，遼寧 朝陽，122000)

由于塑料薄膜包裝在環境中的積累造成污染，且其在高溫下還會產生有害物質，并轉移到食品中，從而帶來人體健康隱患。因此，開發可再生的天然聚合物活性包裝來替代塑料包裝成為當下研究的熱點。天然聚合物包裝材料主要分為蛋白類、脂質類和多糖類[1]。其中多糖類因具有成膜性好、可生物降解、來源廣泛等優點，已在食品、化工、醫藥等領域被廣泛應用。卡拉膠(carrageenan，CA)作為一種主要來源于海洋藻類的天然多糖，因其來源豐富、可生物降解、成本相對較低而備受關注。CA常用于食品的膠凝、乳化、增稠以及穩定劑，并具有防止脂質氧化和穩定蛋白質的優點，由于其優良的凝膠性和高黏度特性，又具有良好的成膜性，可作為一種天然生物活性薄膜基材[2]。然而，CA單一膜在抗氧化、抑菌性方面存在不足，因此，從安全和市場的角度來看，為了延長食品的貨架期，將天然抗氧化劑和可生物降解薄膜結合到一個單一的食品包裝配方中成為了一個具有廣闊前景的方法。

洋蔥(AillumcepaL.)中黃酮類化合物主要以黃酮醇、槲皮素和山奈酚為代表，它們以糖苷的形式主要存在于洋蔥外層干皮中,洋蔥皮乙醇提取物(ethanol extract of onion skins，EEOS)自由基清除率高達93%以上，接近槲皮素清除自由基的能力[3]。LEE等[4]證明洋蔥皮提取物具有潛在的抗菌和抗氧化作用，其抗氧化作用是丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)的2倍。許多研究表明，多酚類物質可增強可食性薄膜的生物活性，CHI等[5]利用K型CA與羥丙基甲基纖維素共混，并添加了富含花青素的葡萄皮粉，制備出了能夠表征豬肉新鮮度的智能薄膜。FARHAN等[6]以CA為基材，與發芽葫蘆巴種子的水提物共混，制備出的活性薄膜可有效抑制貯藏期間雞胸肉表面的微生物生長。另有報道表明，含有酚類化合物的天然抗氧化劑(包括綠茶、獼猴桃、大麥殼、迷迭香和牛至提取物)不僅可以減少肉中的脂質氧化，而且可以延長膜的功能壽命。然而，目前還未見有將EEOS與CA共混，制備復合膜的研究。

因此，本文以CA為基材，與紫色EEOS共混，制備EEOS-CA復合膜，分別從微觀結構、物化性質、生物活性3個方面探討不同濃度的紫色EEOS對CA活性薄膜的影響，為EEOS-CA復合膜的生產及應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色洋蔥皮、豬板油，齊齊哈爾市瀏園市場；食品級CA，青島德慧海洋生物技術有限公司；牛肉膏、胰蛋白胨(生化試劑)，北京奧博星生物技術有限公司；金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)、大腸桿菌(ATCC 25922)，齊齊哈爾大學食品與生物工程學院；其他化學試劑(分析純)，天津凱通化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

2L-ARE旋轉蒸發器，上海皓莊儀器有限公司；GX-220高速不銹鋼多功能粉碎機，浙江高鑫工貿有限公司；2.5 L freezePrysystem型真空冷凍干燥機，美國Labconco公司；S-4300型掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)，日本日立株式會社；Spectrum-100型傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrum，FTIR)儀，美國PerkinElmer公司；Rint-2000型X-射線衍射(X-ray diffractometer，XRD)儀，日本理學株式會社；UPG-722可見分光光度計，北京優譜通用科技有限公司；TA.XT plus型質構儀，英國Stable Micro System公司；GZX-9146MBE型鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 EEOS的制備

取粉碎的紫色洋蔥皮100 g，加入70%乙醇200 mL，在25 ℃下浸提2 h，將浸提液經6 000 r/min的離心處理，取上清液備用。離心后的沉渣再次經過浸提、離心處理，合并2次離心上清液。將合并后的提取液在旋轉蒸發器中真空濃縮(50 ℃)，再將濃縮液冷凍干燥即為洋蔥皮提取物，將洋蔥皮提取物儲存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 EEOS-CA復合膜的制備

稱取6 g CA粉于燒杯中，加入蒸餾水使其質量分數為2%，置于磁力攪拌器于80 ℃下攪拌30 min，使其完全溶解，并用熱水補足蒸發掉的水分。向CA溶液中加入質量分數20%的甘油(在CA質量的基礎上)，繼續攪拌30 min。加入質量分數1%、3%、5%的EEOS(在CA質量的基礎上)繼續攪拌1 h。在60 ℃下水浴1 h以去除氣泡。將直徑為120 mm的聚乙烯環固定在鋪有離型紙的玻璃板上，將35 g膜液澆鑄在聚乙烯環內，固定15 min，置于鼓風干燥箱中在45 ℃下烘干12 h，揭膜，置于25 ℃、相對濕度為56.8%(NaBr飽和溶液)的干燥器中，平衡72 h后測定薄膜的各項指標。

1.3.3 FTIR測定

將平衡干燥后的薄膜置于衰減全反射(attenuated total reflectance，ATR)附件上，測試溫度為25 ℃，波數4 000～650 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32次。

1.3.4 XRD分析

樣品的XRD分析，采用日本理學Rint-2000型XRD儀測量。采用Cu靶，石墨單色器，測試參數為：電壓為45 kV、電流為20 mA，掃描范圍為5～60°(2θ)，掃描速率為2°/min。

1.3.5 SEM

將薄膜樣品剪裁成2 cm×6 cm的矩形，在液氮中破碎。掃描電壓5.00 kV，電流64.0 μA。觀察并拍照薄膜的表面和截面。

1.3.6 厚度的測定

參照GB/T 6672—2001《塑料薄膜和薄片 厚度測定 機械測量法》[7]的方法略作修改，用螺旋測微計(測量精度為0.001 mm)在薄膜上隨機選取10個點測其厚度，計算平均值作為膜的厚度。在計算膜透明度、機械性能、水蒸氣透過率(water vapor permeability，WVP)時，均采用厚度平均值。

1.3.7 WVP的測定

參照郭開紅等[8]的擬杯子法，并略作修改。將10 g無水CaCl2置于鼓風干燥箱中，在110 ℃下烘干2 h，并放置在35 mm×90 mm的稱量瓶中，將制備好的薄膜樣品覆蓋在稱量瓶口，密封，放入底部裝有蒸餾水的干燥器中。每隔24 h稱取稱量瓶的質量(精確到0.000 1 g)，連續測量10 d。每個樣品測量3次，取平均值。薄膜的WVP計算如公式(1)所示:

(1)

式中：WVP，水分透過率，(g·mm)/(m2·d·kPa)；m，薄膜密封后稱量瓶總質量，g；t，時間，d；A，薄膜透水面積，m2；X，薄膜厚度，mm；ΔP，薄膜兩側水蒸氣壓力差，1.583 kPa。

1.3.8 力學性能的測定

薄膜的力學性能采用質構儀進行測定。將薄膜裁剪成6 cm×2 cm的矩形，測試速度2 mm/s，初始夾距20 mm。測量薄膜樣品的拉伸強度及斷裂伸長率。每種樣品測量3次，取平均值。CA薄膜的力學性能計算如公式(2)、公式(3)所示:

(2)

式中：Ts，拉伸強度，MPa；Fmax，膜斷裂時最大負載，N；S，膜橫截面積，mm2。

(3)

式中：EBA，斷裂伸長率，%；l1，膜拉伸后長度，mm；l0，膜初始長度，20 mm。

1.3.9 體外抗氧化性能的測定

將10 mg薄膜樣品與甲醇DPPH溶液(0.2 mmol/L，1.5 mL)混合。將混合液放入暗室反應，在室溫下避光30 min，然后用紫外分光光度計在517 nm處測定混合液的吸光度，DPPH甲醇溶液作為對照[9]。每個樣品測量3次，結果取平均值。自由基清除率計算如公式(4)所示：

(4)

式中：k，自由基清除能力，%；AC，對照組的吸光度；AS，樣品的吸光度。

將ABTS溶解于20 mmol/L、pH 4.5的醋酸緩沖溶液中得到7 mmol/L的ABTS自由基貯液，與過硫酸鉀溶液(混合體系中的終濃度為2.45 mmol/L)混合，在室溫下避光反應12～16 h，使溶液達到穩定的氧化態。測定前用20 mmol/L、pH 4.5的醋酸緩沖溶液按照適當的體積比例(1∶75)稀釋ABTS自由基貯液，使溶液的吸光值在734 nm下達到(0.7±0.02)，以此得到ABTS自由基工作液，該工作液每次測定前現配。將10 mg薄膜樣品與ABTS自由基工作液混合，室溫下避光6 min，用紫外分光光度計在734 nm處測定混合液的吸光度，以醋酸緩沖溶液代替提取物樣品溶液作為空白對照[10]。每個樣品測量3次，結果取平均值。自由基清除率按公式(4)計算。

1.3.10 油脂抗氧化性能的測定

定義2.3[4] 稱系統(1.1)具有持久性，若存在獨立于系統(1.1)的解的正常數mi，Mi(i=1,2,3,4)，使得系統(1.1)的任意解(x(t),y(t),u(t),v(t))T都滿足

薄膜的油脂抗氧化測定采用直接接觸法。參照BAO等[11]方法，并略作修改。將5 g固體豬油包裹于薄膜上，將薄膜進行熱封，置于60 ℃的鼓風干燥箱中加速氧化，每隔24 h定時取樣，按GB 5009.227—2016[12]中的方法測定其過氧化值(peroxide value，POV)，連續測定7 d。每個樣品測量3次，結果取平均值。

1.3.11 抑菌性的測定

參照PELISSARI等[13]方法，并略作修改，可依據抑菌圈直徑大小判斷薄膜的抑菌活性強弱。以大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為受試菌，將活化好的菌種用無菌生理鹽水稀釋10倍，作為初始菌液。用膜用取樣器取直徑為7 mm的薄膜樣品若干，紫外線滅菌后，分別放入含有0.1 mL目標菌液的培養基中，將培養基倒置于(37±1)℃的恒溫培養箱中培養24 h(整個過程在無菌環境中進行)。觀察培養基的菌體生長情況，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。平行實驗3次，取其平均值。

1.3.12 數據處理

實驗結果用均值±標準差表示，通過軟件SPSS 25系統中的Duncan’s進行差異顯著性分析，采用Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 FTIR分析

圖1 EEOS、CA膜及EEOS復合膜的FTIR光譜圖Fig.1 FTIR spectra of EEOS, CA single film and EEOS composite films

2.2 XRD分析

圖2 EEOS、CA膜及EEOS復合膜的XRD譜圖Fig.2 XRD spectra of EEOS, CA single film and EEOS composite films

EEOS在27.21°處出現衍射峰；CA單一膜在16.41°和22.51°出現衍射峰，當EEOS的添加量為1%時，16.41°附近的衍射峰消失，并且22.51°處的衍射峰強度明顯降低。這是由于EEOS的加入打亂了CA骨架結構的有序性，致使薄膜的結晶度下降。隨著EEOS添加量的增加，復合膜衍射峰的強度又有所回升，并且當EEOS添加量為5%時，在16.60°處又出現寬峰，這是由于EEOS中所富含的槲皮素為疏水性物質[17]，隨著EEOS添加量的增加，使得CA中鹽離子的反應難度增大，進而使得鹽離子在薄膜中的密度增大，結晶度也隨之增大。張赟彬等[18]將巴西甜橙精油添加到殼聚糖薄膜中也發現X射線衍射峰強度隨著精油添加量的增加出現先減小后增大的現象。

2.3 表觀圖像及微觀結構分析

CA膜及EEOS復合膜的表觀圖像如圖3所示。CA單一膜無色透明，隨著EEOS的添加，薄膜逐漸變為紅黃色，且隨著EEOS質量分數的增加，薄膜的顏色逐漸加深。

a-CA膜；b-1%EEOS-CA復合膜；c-3%EEOS-CA復合膜； d-5%EEOS-CA復合膜圖3 CA膜及EEOS復合膜的表觀圖像Fig.3 Images of CA single film and EEOS composite films

利用SEM可進一步觀察探究膜的微觀結構以及與添加物之間的相互作用影響。圖4為CA單一膜及EEOS-CA復合膜的表面、截面的SEM圖。CA單一膜的表面較為平整，隨著EEOS添加量的增加，復合膜表面逐漸呈現出隆起結構，這表明EEOS與CA之間發生了相互作用，致使膜表面變得凹凸不平，NOURI等[19]也觀察到了類似的現象。從截面圖可以看出，CA膜結構更為致密，截面較為平整光滑，當添加了EEOS后，截面逐漸變得粗糙，并且可以觀察到EEOS少量不溶顆粒的存在。EEOS的添加量為5%時，截面變得更為粗糙，與表面結構所呈現的現象對應，表明EEOS與CA之間發生相互作用，進而影響了復合膜的空間結構。

A-CA膜表面；B-1%EEOS-CA復合膜表面；C-3%EEOS-CA復合膜表面；D-5%EEOS-CA復合膜表面； a-CA膜截面；b-1%EEOS-CA復合膜截面；c-3%EEOS-CA復合膜截面；d-5%EEOS-CA復合膜截面圖4 CA膜及EEOS復合膜的SEM圖像Fig.4 SEM images of CA single film and EEOS composite films

2.4 厚度和WVP

厚度是薄膜的物理性質中的一個重要指標，厚度的大小影響著薄膜的力學性能和WVP。影響薄膜厚度的因素有很多，例如薄膜的水分含量、所含固形物的多少等。EEOS添加量對薄膜厚度的影響如圖5所示。在0%～5%時，EEOS的添加量和CA膜的厚度成線性關系，EEOS添加量越高，薄膜的厚度越大。所有薄膜在制作時，成膜時的膜液質量和烘干時間相同，而薄膜厚度并不相同，這表明EEOS添加量的不同，使得薄膜之間的分子排列結構也有所差異。這可能由于EEOS的加入，使得羥基、羰基等親水基團增加，從而使薄膜的水分含量增加，薄膜的厚度也隨之增加。并且，隨著EEOS添加量的增加，復合膜中的固形物濃度也隨之增加，使得薄膜的厚度增加[20]。

圖5 CA膜及EEOS復合膜的厚度及WVPFig.5 Thickness and WVP of CA single film and EEOS composite films

WVP是衡量食品包裝膜物理性能的重要指標，它反映了食品包裝膜的滲透性與阻隔性。聚合物的極性是引起水蒸氣滲透的重要原因，由于水蒸氣分子可以和極性基團形成氫鍵，因此，含有極性基團較多的聚合物其吸水性較強，水分子透過薄膜的機會也隨之增多，WVP增大[21]。薄膜的WVP值如圖5所示，CA膜的WVP值為1.61 (g·mm)/(d·m2·kPa)，隨著EEOS添加量的增加，復合膜的WVP值也隨之增加，當添加量為5%時，復合膜的WVP值最大，達到2.33 (g·mm)/(d·m2·kPa)。這表明EEOS的加入影響了CA膜的物理性能，一方面，EEOS的加入使復合膜中—OH基團數量增多，極性增強，WVP也隨之增大；另一方面，通過SEM圖可以看出，隨著EEOS添加量的增加，有少量的不溶性顆粒出現，這些不溶性顆粒使得復合膜的微觀結構出現孔道，致使WVP增加[22]。

2.5 力學性能分析

薄膜的力學性能由拉伸強度和斷裂伸長率表示。由圖6可知，EEOS的添加量為0%～3%時，隨著EEOS添加量的增加，薄膜的拉伸強度由最初的2.63增加到3.71 MPa，斷裂伸長率由13.36%增加到37.95%，而當EEOS的添加量達到5%時，薄膜的拉伸強度降低至2.41 MPa，斷裂伸長率降低至31.53%。這可能由于EEOS的添加，使得CA膜中氫鍵的數量增加，從而增加了卡拉骨架結構的內聚力，提高了薄膜內空間網狀結構的穩定性，起到了交聯的作用，使得薄膜的拉伸強度有所提高[23]。當EEOS達到一定濃度時，拉伸強度最佳，在此基礎上繼續添加EEOS，過量的EEOS在CA膜中的分散性變差，薄膜的空間網狀結構受到破壞，致使其拉伸強度降低。由于EEOS中富含的黃酮醇類化合物，不僅能起到交聯的作用，還對CA膜有一定的增塑作用，從而在一定范圍內，薄膜的斷裂伸長率有所提高，而當EEOS的添加量超過最大限度時，使得薄膜的斷裂伸長率減弱。

圖6 CA膜及EEOS復合膜的力學性能Fig.6 Mechanical properties of CA single film and EEOS composite films

2.6 體外抗氧化性能分析

類黃酮化合物的抗氧化能力與羥基數量成正相關[24]，而洋蔥皮中富含的槲皮素、槲皮苷等化合物中，羥基所釋放的氫質子可清除氧自由基，從而起到抗氧化作用[25]。復合膜的體外抗氧化能力如圖7所示。

圖7 CA膜及EEOS復合膜的體外抗氧化性能Fig.7 Antioxidant properties in vitro of CA single film and EEOS composite films

CA單一膜對DPPH和ABTS陽離子自由基清除能力較弱，而隨著EEOS濃度的增加，復合膜對自由基的清除能力也顯著提升。當EEOS質量分數為5%時，DPPH自由基清除率達到45.28%；而對ABTS陽離子自由基的清除能力也由9.81%增長到89.14%。

2.7 油脂抗氧化分析

油脂氧化的實質是具有不飽和鍵物質的氧化酸敗過程，包括鏈引發、鏈傳遞和鏈終止3個階段[26]，而洋蔥皮中所含的類黃酮化合物可釋放出氫質子，清除鏈引發階段產生的自由基，達到抑制油脂氧化的目的[27]。油脂氧化過程的POV如圖8所示，POV越大表明其氧化程度越大。未經包裹的豬油在7 d內氧化程度明顯，由0.22增長到2.49 g/100 g。經薄膜包裹后，豬油在7 d內的POV明顯低于未包裹的樣品，表明復合膜對豬油的氧化起到抑制作用。然而，CA單一膜、1%及3% EEOS-CA復合膜對豬油氧化的抑制效果差異并不顯著。而5% EEOS-CA復合膜對豬油氧化的抑制效果較差，在第7天，豬油的POV達到0.74 g/100 g。這與體外抗氧化能力的測定結果不同，并不是EEOS的濃度越大復合膜的抗氧化效果越好。這可能是由于隨著EEOS添加量的增加，復合膜的微觀結構和致密性受到了影響，從而使薄膜阻隔氧氣透過的能力減弱。而經EEOS質量分數為3%的復合膜包裹的豬油在第7天時的POV較低，為0.122 g/100 g，表明在此質量分數下的復合膜對豬油氧化的抑制作用效果較好。

圖8 CA膜及EEOS復合膜的油脂抗氧化性能Fig.8 Antioxidant properties in axunge of CA single film and EEOS composite films

2.8 抑菌性分析

復合膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑如表1所示。CA單一膜對大腸桿菌的抑制效果并不明顯，而對金黃色葡萄球菌的抑制效果更為明顯，并且復合膜對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑更大，說明薄膜對革蘭氏陽性菌的抑菌效果優于革蘭氏陰性菌，這個結論與NOURI等[19]的報道一致。造成這種差異的原因主要是2種微生物的細胞壁結構不同，革蘭氏陰性菌的細胞壁為多層結構，從內到外依次為肽聚糖層、脂蛋白層、磷脂層和脂多糖層，其細胞壁不易滲透親脂性溶質，從而保護其內部結構不易受到外部侵害；而革蘭氏陽性菌的細胞壁結構簡單，僅由1層肽聚糖和磷壁酸組成，不含脂多糖，因此更易受到抑菌劑的抑制作用[28]。當添加EEOS后，對薄膜的抑菌效果有所改善，抑菌圈直徑隨著添加物濃度的增大而逐漸增大，EEOS含有的類黃酮化合物可以通過過氧化氫途徑，降低細胞膜的流動性或對膜穿孔，進而破壞微生物的細胞膜，導致微生物細胞分泌紊亂，從而抑制微生物生長。

表1 CA膜及EEOS復合膜對微生物的抑菌圈直徑Table 1 Diameter of bacteriostasis circle of CA single film and EEOS composite films

3 結論

本文通過加入0%～5%質量分數的紫色EEOS與CA共混，制備復合膜。FTIR、XRD以及SEM的結果顯示，EEOS的加入影響了復合膜的微觀結構，薄膜的表面及截面隨著EEOS濃度的增加而變得粗糙；EEOS的加入影響了薄膜的力學性能，其質量分數在3%時，薄膜具有較好的力學性能，而WVP值隨著EEOS質量分數的增加而增加；薄膜的DPPH和ABTS陽離子自由基清除率隨著EEOS質量分數的增加而顯著上升，油脂抗氧化的實驗結果顯示，EEOS質量分數為5%的薄膜包裹的豬油在第7天時的POV較高，而質量分數為3%的薄膜效果最好，其包裹的豬油在第7天時POV最低；抑菌性試驗結果顯示，抑菌圈直徑隨著提取物質量分數的增加而增加，且薄膜對于革蘭氏陽性菌的抑制作用優于革蘭氏陰性菌。綜上所述，當EEOS質量分數為3%時，薄膜的綜合性能最佳，研究結果可為紫色EEOS-CA復合膜的生產和應用提供參考。